برای تحلیل کروموزومی نمونه فانکونی

برای تحلیل کروموزومی نمونه فانکونی (Fanconi Anemia)

 در زمینه شکست کروموزومی، مراحل زیر می‌تواند مفید باشد:کم خونی فانکونی یک اختلال اتوزومال مغلوب نادر است که از نظر فنوتیپی و ژنتیکی ناهمگن است.  نارسایی متعاقب مغز استخوان معمولاً با ترومبوسیتوپنی شروع می شود و معمولاً به کم خونی آپلاستیک (AA) پیشرفت می کند. 

پیوند با سلول های بنیادی خونساز در حال حاضر تنها درمان درمانی برای اصلاح نارسایی مغز استخوان و همچنین کاهش خطر ابتلا به سرطان خون است. بیماران مبتلا به FA به سیکلوفسفامید، بوسولفان، پرتوهای یونیزان و سایر عوامل ژنوتوکسیک حساس هستند. 

بیماران FA همچنین مستعد ابتلا به پیامدهای التهابی مخرب بیماری پیوند در مقابل میزبان هستند. بنابراین، بیماران FA نیاز به درمان خاصی دارند و تشخیص باید برای تشخیص FA از سایر بیماری های هماتولوژیک ارثی ایجاد شود.  تلاش ها همچنین بر کاهش دوز سمیت رژیم های آماده سازی مورد نیاز برای پیوند و استفاده از درمان های تهویه جایگزین متمرکز شده است.
تقریباً یک سوم از بیماران FA هیچ ناهنجاری آشکار فیزیکی / جسمی ندارند.  از سوی دیگر، بیمارانی که علائم مشابه FA دارند ممکن است از FA رنج نبرند. چندین شرایط ژنتیکی وجود دارد که در آنها نارسایی مغز استخوان یک ویژگی همپوشانی است: برای مثال، کم خونی دیاموند-بلک فن، سندرم شواچمن-الماس یا سندرم شکستن نایمگن - که تشخیص افتراقی آنها ممکن است به آزمایش‌های ژنتیکی و غیر ژنتیکی زیادی نیاز داشته باشد. 

در حال حاضر، واریانت های بیماری زا در 23 ژن گزارش شده است که باعث FA می شوند. با این حال، فقدان جهش های بی آللی شناسایی شده در ژن های FA را نمی توان به عنوان رد تشخیص FA درک کرد، و انواع با اهمیت ناشناخته نیاز به آزمایش های عملکردی بیشتری برای تصمیم گیری در مورد بیماری زایی آنها دارند. بنابراین، سایر آزمایشات تاییدی از اهمیت بالایی برخوردار هستند. افزایش فراوانی شکست کروموزوم برای اولین بار در بیماران FA توسط شرودر و همکاران توصیف شد.  پس از آن، شولر و همکاران. نشان داد که مکمل‌سازی محیط کشت با عوامل پیوند متقابل DNA، فرکانس اندازه‌گیری شده شکست‌های DNA را در نمونه‌های بیماران FA افزایش می‌دهد.  پیشنهاد شد که حساسیت میتومایسین C (MMC) یا دی اپوکسی بوتان (DEB) ممکن است به طور قابل اعتمادی بین موارد FA و غیر FA تمایز قائل شود.  تست های شکست کروموزومی را می توان به همان اندازه با ارزش اما بسیار ارزان تر از آزمایش های مولکولی ژن های FA بر اساس DNA در نظر گرفت. پس از اینکه نتیجه تست شکستگی مثبت به دست آمد، غربالگری برای جهش در ژن های شناخته شده FA ضروری است.

 کشت لنفوسیت
نمونه‌های خون هپارینه‌شده جمع‌آوری شد و آماده‌سازی‌های کروموزوم خود به خود، MMC-القا شده و القا شده با بلئومایسین استفاده شد. خون (0.8 میلی لیتر) در محیط کشت سلولی RPMI-16740 تکمیل شده با آلبومین سرم گاوی (15٪) و پنی سیلین/استرپتومایسین (100 U/mL/100μg/mL، Gibco، Thermo Fisher Scientific Inc.، Waltham، MA) و phytohaemaglut (2٪) و فیتو، امگاگلوتین (2%) برای القای تقسیم سلولی انکوباسیون 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد به منظور انجام آنالیز کروموزوم در اولین تقسیم سلولی انجام شد. تکثیر بیشتر با کولسمید (0.1 میکروگرم در میلی لیتر، Gibco) در ساعت 46 متوقف شد. سپس لنفوسیت ها در محلول هیپوتونیک (0.075 مولار KCl) به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد تعلیق شدند و با مخلوط متانول-استیک اسید سرد 3:1 تثبیت شدند. پس از چندین بار شستشو در فیکساتور، سوسپانسیون سلولی غلیظ روی لام های شیشه ای ریخته شد و با محلول Giemsa  رنگ آمیزی شد.

 آزمایش میتومایسین
کشت خون کامل از بیماران و افراد سالم به منظور آنالیز سیتوژنتیک استاندارد تهیه می‌شود. در این روش، 50 نانوگرم در میلی لیتر متومایسین-C (MMC) به کشت اضافه می‌شود و سپس کشت به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود. برای مهار تکثیر، 0.1 میکروگرم در میلی لیتر کلسمید (Gibco) استفاده می‌شود.

Principle For the diagnosis of the recessive genetic disorder Fanconi anemia by detection of the increased chromosome breakage caused  by specific chromosome clastogens

Mitomycin C (MMC) and diepoxybutane (DEB) are known chromosome clastogens.  Individuals with a normal chromosome repair mechanism when exposed to low levels of MMC for 96 hours or DEB for  48 hours show low level breakage (<6% of cells with radials as a rule) while cells from subjects with Fanconi anemia exposed  to comparable concentrations of clastogens show

 Safety warnings

All tissue specimens should be handled as biohazardous, using Universal Precautions. Use the laminar flow hood for all steps  up to harvest spin. Wear a laboratory coat and protective gloves for all steps through slide‐making. Avoid spills and contact of  any biological materials with skin or mucous membranes. Clean up spills immediately with fresh Sanimaster 4 (made weekly).  Cover cuts with protective bandages even when gloves are worn. Dispose of Pasteur pipettes in sharps container. Wash hands  thoroughly after removing gloves. Mitomycin C, Colcemid, and diepoxybutane are toxic chemicals and should be handled accordingly. Avoid contact with skin. Diepoxybutane (DEB) is a CARCINOGEN, toxic, mutagenic, irritant. Flush for 15 minutes in case of contact. Readily  absorbed through skin, wear gloves and lab coat at all times. Mitomycin C (MMC) is a CARCINOGEN, toxic, mutagenic, irritant; may be fatal if swallowed or absorbed through the  skin. Overexposure may cause reproductive disorders. Flush skin or eyes for 15 minutes in case of contact. Seek medical attention if swallowed. Wear gloves and lab coat at all times when handlingmarkedly increased and multiple radial forms

هشدارهای ایمنی

تمام نمونه‌های بافتی باید به عنوان مواد زیست‌خطر در نظر گرفته شوند و از احتیاط‌های عمومی استفاده شود. از هود جریان لامینار برای تمام مراحل تا زمان چرخش برداشت استفاده کنید. در تمام مراحل تا زمان تهیه اسلاید، از لباس آزمایشگاهی و دستکش‌های محافظ استفاده کنید. از ریختن مایعات و تماس هرگونه مواد بیولوژیکی با پوست یا غشاهای مخاطی خودداری کنید. در صورت ریختن مایعات، بلافاصله با محلول Sanimaster 4 تازه (تهیه شده به صورت هفتگی) تمیز کنید. حتی زمانی که دستکش پوشیده‌اید، زخم‌ها را با باندهای محافظ بپوشانید. پیپت‌های پاستور را در ظرف زباله‌های تیز دور بریزید. پس از درآوردن دستکش‌ها، دست‌ها را به طور کامل بشویید.

میتومایسین C، کلسیمید و دی‌اپوکسی‌بوتان مواد شیمیایی سمی هستند و باید به همین ترتیب با آنها رفتار شود. از تماس با پوست خودداری کنید.دی‌اپوکسی‌بوتان (DEB) یک ماده سرطان‌زا، سمی، جهش‌زا و تحریک‌کننده است. در صورت تماس، به مدت 15 دقیقه شستشو دهید. به راحتی از طریق پوست جذب می‌شود، بنابراین در تمام زمان‌ها دستکش و لباس آزمایشگاهی بپوشید.

میتومایسین C (MMC) یک ماده سرطان‌زا، سمی، جهش‌زا و تحریک‌کننده است؛ ممکن است در صورت بلع یا جذب از طریق پوست کشنده باشد. قرارگیری بیش از حد ممکن است باعث اختلالات باروری شود. در صورت تماس با پوست یا چشم‌ها، به مدت 15 دقیقه شستشو دهید. در صورت بلع، به دنبال مراقبت‌های پزشکی باشید. در تمام زمان‌ها هنگام کار با آن، دستکش و لباس آزمایشگاهی بپوشید.

تجزیه و تحلیل متافازها با استفاده از یک میکروسکوپ نوری (بزرگنمایی 1500×، Olympus CH 2) انجام می‌گردد. از هر بیمار 100 متافاز بررسی شده و فقط سلول‌های متافاز گرد و شفاف شمارش می‌شوند. انحرافات زیر مورد ارزیابی قرار می‌گیرند:

• شکاف کروماتید: وقفه در رنگ‌آمیزی کروماتید به میزان 1-2 برابر عرض کروماتید.
• شکستن کروماتید: وقفه‌ای که بیش از دو برابر عرض است یا قطعه شکسته کروماتید به نظر جابجا شده می‌باشد.
• کروموزوم سه شعاعی: شکلی که احتمالاً ناشی از ترمیم نادرست دو شکست در دو کروموزوم متمایز است.
• کروموزوم چهار شعاعی: شکلی تبادلی ناشی از ترمیم نادرست دو کروماتید شکسته در کروموزوم‌های مختلف.

کروموزوم‌های سه شعاعی و چهار شعاعی به عنوان دو شکست شمارش می‌شوند. تمامی انحرافات به عنوان کل شکست در هر سلول، درصد سلول‌های نابجا، و درصد سلول‌هایی که ≥10 b/c دارند، ثبت می‌گردند. کشت از گروه کنترل سالم نشان‌دهنده 1٪-5٪ از 5-10 b/c (شکستگی/سلول) است.

در عمل، بیمارانی که بیش از 60 درصد از سلول‌ها با 10 شکست یا بیشتر دارند، به عنوان مبتلا به آنمی فانکونی (FA) تشخیص داده می‌شوند. این بیماران پس از تأیید ژنتیکی FA تحت روش‌های درمانی جایگزین، شامل پیوند مغز استخوان، قرار می‌گیرند.

در مواردی که بیش از 10٪ از سلول‌ها دارای ≥10 b/c یا بیش از 10٪ سلول‌های نابجا هستند، احتیاط در استفاده از عوامل ژنوتوکسیک در درمان بیماران ضروری است.

انجمن های ژنوتیپ/فنوتیپ در کم خونی فانکونی
کم خونی فانکونی یک بیماری ژنتیکی و بالینی ناهمگن است. در برخی موارد، دانستن ژن و واریانت(های) خاص می تواند یک جزء حیاتی برای شناسایی خطر بالقوه و تلاش برای درک سیر بالینی باشد. مدیریت پزشکی برای اکثر افراد مبتلا به FA مطابق با تظاهرات بالینی آنها خواهد بود. با این حال، برای افراد دارای انواع ژن‌هایی که فنوتیپ‌های تغییر یافته دارند، شناسایی ژنوتیپ برای مدیریت پزشکی مناسب و برای اهداف پیش‌آگهی ضروری است، به‌ویژه که ژن‌های دارای فنوتیپ‌های شبه FA ممکن است علائم کلاسیک FA را حذف کنند. مهم است که تشخیص داده شود که اطلاعات ژنوتیپ/فنوتیپ اغلب بر اساس تعداد محدودی از موارد است و نقاط پرت نسبت به فنوتیپ سنتی مشاهده شده است. چندین نوع FA که اطلاعات کافی برای آنها در دسترس است در زیر آمده است.
FANCAیک مطالعه گزارش داد که افراد دارای واریانت‌های پوچ هموزیگوت در ژن FANCA در سنین پایین‌تر به کم خونی مبتلا می‌شوند و نسبت به افراد با عملکرد باقی‌مانده واریانت‌های FANCA، شیوع بیشتری از لوسمی دارند [44]. با این حال، یک تجزیه و تحلیل جداگانه نشان داد که سن شروع کم خونی و بروز لوسمی در بیماران مبتلا به واریانت های FANCA تهی هموزیگوت یا در بیمارانی که شکل غیر طبیعی پروتئین را بیان می کنند، تغییری نکرده است [45]. انواع خاص ممکن است به پیش بینی فنوتیپ مانند انواع p.His913Pro و p.Arg951Gln/Trp کمک کند که در ارتباط با شروع بعدی بیماری و پیشرفت خونی آهسته گزارش شده است.

FANCB
مردان دارای یک نوع کوتاه کننده در ژن FANCB اغلب با یافته های آشکار مطابق با VACTERL-H [47] تظاهر می کنند، اگرچه یک فنوتیپ خفیف تر برای بیماران مبتلا به واریانت های نادرست یا موزائیسم جسمانی گزارش شده است [48، 49]. به نظر نمی رسد حاملان زن FANCB یافته های بیماری مرتبطی داشته باشند .

FANCC
ثبت بین المللی کم خونی فانکونی (IFAR) اشاره کرد که افراد دارای واریانت های FANCC در مقایسه با افراد دارای واریانت های FANCA یا FANCG، سن شروع نارسایی مغز استخوان زودتر و بقای ضعیف تری داشتند [51]. این یافته توسط گروه تحقیقاتی FA اروپا گزارش نشده است، که در مقایسه با FANCA و FANCG، کم‌ترین شدت هماتولوژیک و ناهنجاری‌های جسمی کمتر را در گروه FANCC توصیف می‌کند [44]. چندین گونه در ژن FANCC با فنوتیپ های خاص مرتبط است. واریته‌های واقع در ناحیه‌ای از ژن به نام اگزون 15 (از نظر تاریخی اگزون 14) در ارتباط با ایجاد ناهنجاری‌های خونی در سنین پایین‌تر، ناهنجاری‌های مادرزادی بیشتر و بقای ضعیف‌تر در مقایسه با افرادی که واریانت‌هایی در اگزون 2 دارند (از نظر تاریخی اگزون 1) گزارش شده‌اند [51، 52]. نوع c.456+4A>T (که قبلا به عنوان IVS4+4A>T شناخته می شد) نیز در ارتباط با تظاهرات شدیدتر بیماری در افراد یهودی اشکنازی گزارش شده است [52، 53]. با این حال، این نوع در سایر جمعیت ها گزارش شده است [54، 55] و ممکن است با یک فنوتیپ شدید در گروه های خاص مرتبط نباشد [56]. چندین مطالعه نشان می دهد که نوع بنیانگذار c.67delG (که قبلاً 322delG نامیده می شد) با علائم خفیف تری همراه است، اما استثناهایی مشاهده شده است [52، 53، 57]. یک مطالعه در جمعیت عربستان سعودی گزارش داد که نوع بنیانگذار c.165+1G>T نیز ممکن است با شکل خفیف این بیماری مرتبط باشد

FANCD1/BRCA2
مطالعه‌ای که در سال 2002 منتشر شد، گزارش داد که افراد مبتلا به FA و گونه‌های دو آللی بیماری‌زای ژن BRCA2 ممکن است در سنی بسیار زودتر از حد انتظار دچار لوسمی، لوسمی میلوئید حاد (AML) یا لوسمی لنفوبلاستیک حاد (ALL) شوند [59]. آنها همچنین در معرض خطر ابتلا به تومورهای جامد مغز (مانند مدولوبلاستوما، گلیوبلاستوما مولتی فرم، آستروسیتوم) و کلیه (مثلاً تومور ویلمز) هستند که معمولاً در FA دیده نمی شوند [60، 61]. اگر بیمار دارای انواع بی آللی FANCD1/BRCA2 است، غربالگری اضافی با تصویربرداری تشدید مغناطیسی مغز (MRI) و سونوگرافی کلیه باید در نظر گرفته شود [62]. در حالی که برخی از مطالعات در این جمعیت یک فنوتیپ شدید، از جمله ناهنجاری های مادرزادی متعدد و خطر 97 درصد ابتلا به هر گونه بدخیمی را تا سن 5.2 سالگی نشان داده اند [60]، گزارشی از افراد مسن با شروع بیماری خفیف تر یا دیرتر وجود دارد.

FANCG
گروه تحقیقاتی FA اروپا گزارش داد که افراد دارای واریانت های بیماری زا در FANCG سیتوپنی شدیدتر و بروز لوسمی بالاتری نسبت به بیماران دارای واریانت های دیگر ژن های FA داشتند [44]، اما این الگو در مجموعه داده های جمع آوری شده توسط IFAR [51] مشاهده نشد.

FANCM
به طور کلی، اطلاعات بیشتری برای درک بهتر فنوتیپ FANCM مورد نیاز است. FANCM در سال 2005 پیشنهاد شد تا به عنوان یک ژن کمپلکس هسته FA و مرتبط با فنوتیپ FA در خانواده ای با خواهر و برادر مبتلا باشد [65]. واریته‌های بیاللیک FANCA بعداً در خواهر و برادر مبتلا شناسایی شدند و سؤال FANCM را به عنوان یک ژن متعارف FA مطرح کردند [66]. از آن زمان، انواع FANCM از دست دادن عملکرد بی آللی در افراد مبتلا به FA شناسایی شده است، و برخی از نویسندگان یک فنوتیپ جایگزین مرتبط با سندرم سرطان زودرس را به جای فنوتیپ کلاسیک FA پیشنهاد می کنند، زیرا گروه های آنها فاقد نارسایی مغز استخوان و ناهنجاری های مادرزادی بودند [67، 68]. در سال 2014 گزارش شد که یک بیمار با انواع FANCM هتروزیگوت ترکیبی، شکنندگی کروموزوم، ناهنجاری های برجستگی انگشت شست و تنار دست راست و نارسایی مغز استخوان را نشان داد [69]. گزارش‌هایی از سرطان پستان با شروع زودرس و کاهش باروری (نارسایی اولیه تخمدان و اسپرم‌زایی خفیف تا شدید در دو خانواده) در حامل‌های احتمالی دو آللی بدون فنوتیپ آشکار نیز منتشر شده است [68، 70، 71]. بخش خطر سرطان برای ناقلین را در این فصل ببینید.

FANCN/PALB2
انواع ژن FANCN/PALB2 معمولاً با تظاهرات بالینی شدیدتری همراه است. مشابه فنوتیپ FANCD1/BRCA2، افراد دارای واریانت های FANCN/PALB2 در سنین پایین تر نسبت به بیماران دارای واریانت های دیگر ژن های FA به تومورهای جامد و لوسمی مبتلا می شوند [72]. تومورهای شایع گزارش شده شامل مدولوبلاستوما، تومور ویلمز، AML و نوروبلاستوما [72-74] است. توصیه‌های نظارت بر سرطان برای بیماران مبتلا به انواع دو آللی FANCD1/BRCA2 نیز ممکن است برای افراد مبتلا به انواع FANCN/PALB2 در غیاب دستورالعمل‌های اجماع در نظر گرفته شود. فنوتیپ های خارج از این طیف گزارش شده است [75] که نشان می دهد موارد اضافی در طول زمان ممکن است طیف فنوتیپی FA مرتبط با FANCN/PALB2 را بیشتر گسترش دهد.

FANCO/RAD51C
دو خانواده با یک اختلال شبه FA و انواع دو آللی در FANCO/RAD51C گزارش شده است [76، 77]. در هر دو خانواده، افراد مبتلا با ناهنجاری‌های مادرزادی قابل توجهی از جمله برخی از آنومالی‌های غیر معمول در FA کلاسیک مانند ناهنجاری‌های کام، هولوپروسسفالی و روی هم افتادن انگشتان مراجعه کردند. حساسیت به دی اپوکسی بوتان (DEB) و میتومایسین C (MMC) و افزایش شکست های شعاعی تشخیص FA را تایید کرد. خطر ویژگی های هماتولوژیک و تومورهای سلول سنگفرشی ناشناخته باقی مانده است.

FANCR/RAD51
در حالی که اکثر ژن های مرتبط با FA به یک نوع بیماری زا در هر دو نسخه از یک ژن FA نیاز دارند، تنها یک نوع بیماری زا در ژن FANCR/RAD51 برای ایجاد بیماری لازم است. در دو مورد گزارش‌شده، به نظر می‌رسد که نوع FANCR/RAD51 به‌صورت de novo در پروباند بوده است، که منجر به یک فنوتیپ FA مانند می‌شود که شامل ناهنجاری‌های مادرزادی است، اما تاکنون با بیماری‌های هماتولوژیک یا سرطان‌ها مرتبط نبوده است.

FANCS/BRCA1
اولین مورد تایید شده واریانت های بیاللی FANCS/BRCA1 در یک زن 28 ساله با سرطان تخمدان سروزی پاپیلاری مرحله IV و سمیت شدید برای درمان سیس پلاتین گزارش شد، اگرچه تشخیص با تجزیه و تحلیل شکست کروموزوم تایید نشد [80]. مورد دوم یک زن 23 ساله مبتلا به کارسینوم سینه مجرای ابتلا به FA از طریق مطالعات شکست کروموزوم تایید شد [81]. هر دوی این افراد با قد کوتاه، میکروسفالی، بدشکلی و درجاتی از ناتوانی ذهنی یا رشدی مراجعه کردند. یک نشریه اخیر گزارش داد که دو خانواده با چهار فرزند دارای مطالعات شکست کروموزوم مطابق با FA، و همچنین انواع هموزیگوت بریده BRCA1 هستند. هر چهار کودک ناهنجاری های مادرزادی و کمبود رشد داشتند. یک کودک در 5 سالگی به لوسمی لنفوسیتی حاد سلول T و کودک دوم در 2 سالگی به نوروبلاستوما مبتلا شد. دو کودک باقی مانده در 5 سالگی و 15.5 سالگی بدون سرطان بودند [82]. مورد دیگری که با شکست کروموزوم تایید شد مربوط به یک زن 2.5 ساله با قد کوتاه، میکروسفالی، تاخیر در رشد عصبی و بدشکلی اما بدون سابقه سرطان بود [83]. هیچ یک از موارد گزارش شده دچار نارسایی مغز استخوان نشده اند.

FANCQ/ERCC4
علاوه بر فنوتیپ FA، انواع بی آللی در FANCQ/ERCC4 با سندرم اتوزومال مغلوب Cockayne، خشکی پیگمنتوزوم و یک مورد از سندرم پروژروئید XFE مرتبط است. افراد مبتلا می توانند با یک فنوتیپ منفرد یا فنوتیپ های همزمان، بسته به اینکه عملکرد ژن چگونه تحت تاثیر قرار می گیرد، مراجعه کنند.

FANCR/RAD51
انواع تک آللی در FANCR/RAD51 با حرکات آینه مادرزادی اتوزومال غالب (CMM) گزارش شده است [88، 89]. تا به امروز، فنوتیپ های FA و CMM در یک فرد گزارش نشده است.

۱. نمونه‌گیری

• جمع‌آوری نمونه: معمولاً از خون محیطی بیمار یا مایع مغزی-نخاعی استفاده می‌شود.
• کشت سلولی: نمونه‌های جمع‌آوری شده در محیط‌های کشت مناسب باید کشت داده شوند تا سلول‌ها به تعداد کافی برای آنالیز برسند.

۲. آماده‌سازی نمونه

• متافاز: سلول‌ها وقتی به چرخه تقسیم می‌رسند در مرحله متافاز قرار می‌گیرند، که در این مرحله کروموزوم‌ها به خوبی قابل مشاهده‌اند.
• افتراق کروموزوم: سلول‌ها باید با استفاده از مواد شیمیایی مانند (Colcemid) متوقف شده و سپس با محلول‌های مناسب دچار همولیز شوند.

۳. رنگ‌آمیزی کروموزومی

• رنگ‌آمیزی: کروموزوم‌ها با رنگ‌آمیزهای خاصی مانند Giemsa یا Banding staining رنگ‌آمیزی می‌شوند تا الگوهای کروموزومی قابل شناسایی باشند.

۴. تحلیل شکاف‌های کروموزومی

• میکروسکوپ نوری: با استفاده از میکروسکوپ نوری، کروموزوم‌ها تحت بررسی قرار می‌گیرند.
• شناسایی شکاف‌ها: مشخص کردن شکست‌ها، حذف‌ها یا تکرارهای کروموزومی به بررسی الگوهای غیرطبیعی کمک می‌کند.

۵. تجزیه و تحلیل داده‌ها

• تجزیه و تحلیل آماری: مقایسه کروموزوم‌ها با نمونه‌های سالم برای شناسایی میزان شکست و نوع تغییرات.
• توجه به کروموزوم‌های خاص: به ویژه کروموزوم‌های ۱، ۷ و ۱۶ که با فنکونی آنمی مرتبط هستند.

۶. تفسیر نتایج

• تعیین نوع انحرافات: انحرافات کروموزومی مشخص شده می‌تواند نمایانگر نوع خاصی از اختلالات ژنتیکی باشد.
• کنترل‌های داخلی و خارجی: استفاده از کنترل‌های شناخته شده برای اعتبارسنجی نتایج.

۷. مشاوره و پیگیری

• مشاوره ژنتیک: ارائه مشاوره به بیمار و خانواده در مورد نتایج و عواقب آن‌ها.
• پیگیری: بررسی‌های دوره‌ای برای نظارت بر وضعیت بیمار و احتمال تطورات جدید.

اگر سوال خاصی در مورد هر یک از مراحل دارید یا نیاز به توضیحات بیشتری دارید، خوشحال می‌شوم که کمک کنم!

در مورد انالیز کروموزومی شکست ها تعداد شکست ها و نوع شکست ها بیشتر توضیح بدهید و نحوه محاسبه را بنویسید

تحلیل کروموزومی: شکست‌ها و نوع آن‌ها

در آنالیز کروموزومی، شکست‌های کروموزومی می‌توانند به شکل‌های مختلفی بروز کنند و شناسایی دقیق آن‌ها بسیار حائز اهمیت است. در زیر، به جزئیات بیشتری درباره نوع و تعداد شکست‌ها و همچنین نحوه محاسبه آن‌ها پرداخته می‌شود.

۱. انواع شکست‌های کروموزومی

شکست‌های کروموزومی معمولاً به چند دسته اصلی تقسیم می‌شوند:

• شکست‌های تک رشته‌ای (Single-strand breaks):
  • شکست در یکی از دو رشته DNA که می‌تواند منجر به ایجاد قارچ‌های کروموزومی شود.
• شکست‌های دو رشته‌ای (Double-strand breaks):
  • این نوع شکست می‌تواند به شدت خطرناک باشد و ممکن است منجر به حذف یا انتقال بخش‌هایی از کروموزوم شود.
• دوباره‌پیوندها (Rejoins):
  • بعد از شکست، کروموزوم‌ها ممکن است دوباره به یکدیگر پیوند خورده و منجر به ایجاد کروموزوم‌های غیرطبیعی شوند.
• حذف‌ها (Deletions):
  • جزئیاتی از کروموزوم ممکن است از بین برود که می‌تواند بر عملکرد ژن‌ها تأثیر گذار باشد.
• تکرارها (Duplications):
  • قطعاتی از کروموزوم ممکن است تکرار شود که می‌تواند به افزایش تعداد ژن‌ها و اثرات معکوس منجر شود.
• انتقال‌ها (Translocations):
  • بخشی از یک کروموزوم ممکن است به کروموزوم دیگر منتقل شود که می‌تواند بر بیان ژن‌ها تأثیر بگذارد.

۲. نحوه محاسبه تعداد شکست‌ها و نوع آن‌ها

برای محاسبه تعداد و نوع شکست‌ها، از مراحل زیر می‌توان استفاده کرد:

الف. جمع‌آوری داده‌ها

• مشاهده کرافت (Chromosome spreads): بعد از کشت سلولی و رنگ آمیزی، کرافت‌های کروموزومی تحت میکروسکوپ مشاهده می‌شوند.
• شمارش شکست‌ها: شمارش دقیق تعداد شکست‌ها در هر کروموزوم و در هر سلول.

ب. ثبت و طبقه‌بندی

• جدول گذاری: ثبت و طبقه‌بندی انواع شکست‌ها (تک رشته‌ای، دو رشته‌ای، حذف، تکرار و غیره) در یک جدول.

• نوع شکست	تعداد شکست‌ها	شکست تک رشته‌ای	شکست دو رشته‌ای	حذف

ج. محاسبه نرخ شکست

• نرخ شکست کل:

نرخ شکست=تعداد کل شکست‌هاتعداد کل کروموزوم‌ها×تعداد سلول‌ها×100نرخ شکست=تعدادکل کروموزوم‌ها×تعدادسلول‌هاتعدادکل شکست‌ها×100

• نرخ شکست بر حسب نوع: برای هر نوع شکست، می‌توان نرخ را به صورت زیر محاسبه کرد:

نرخ شکست نوع خاص=تعداد شکست نوع خاص تعداد کل کروموزوم‌ها×تعداد لول‌ها×100نرخشکستنوعخاص=تعدادکلکروموزوم‌ها×تعدادسلول‌هاتعدادشکست نوع خاص×100

۳. تفسیر نتایج

• تأثیرات بالینی: با توجه به نوع و تعداد شکست‌ها، می‌توان به تجزیه و تحلیل وضعیت بیمار، پیش‌بینی عواقب بالینی و تصمیم‌گیری در مورد درمان پرداخت.
• مطالعه تطبیقی: بررسی نتایج در مقایسه با نمونه‌های سالم برای درک اینکه آیا نتایج نشان‌دهنده یک اختلال خاص هستند یا خیر.

این پروسه به محققین و پزشکان کمک می‌کند تا وضعیت ژنتیکی بیمار را بهتر درک کنند و به پیش‌بینی عواقب بالقوه بپردازند. اگر سوالات بیشتری دارید یا نیاز به جزئیات بیشتری نیاز دارید، در خدمت شما هستم!

خلاصه :

تست استاندارد طلایی برای تشخیص کم خونی فانکونی (FA) آزمایش شکست کروموزوم (CBT) با استفاده از عوامل پیوند دهنده DNA میتومایسین C (MMC) و دی اپوکسی بوتان (DEB) است. ، آزمایش بیشتری لازم نیست مگر اینکه شک بالینی قوی وجود داشته باشد. در این صورت باید CBT سلول پوست انجام شود. اگر CBT نتیجه مثبت داشته باشد ، پانل ژن هدفمند FA باید انجام شود. اگر پانل هدف منفی باشد، می توان توالی یابی کل اگزوم یا کل ژنوم را انجام داد. یک نتیجه مبهم یا غیرقطعی به توالی‌یابی نسل بعدی برای انواعی که باعث سایر سندرم‌های بی‌ثباتی کروموزوم می‌شوند، یا یک CBT پوست برای تأیید FA نیاز دارد.
آزمایشگاه همچنین باید شکستگی کروموزوم پایه را با ارزیابی سلول هایی که با MMC و/یا DEB درمان نشده اند اندازه گیری کند. اندازه گیری شکستگی پایه می تواند به طور قابل توجهی در بین بیماران با انواع مختلف FA متفاوت باشد. به عنوان مثال، بیماران دارای واریانت‌هایی در ژن‌های FANCD1/BRCA2 یا FANCN/PALB2 در مقایسه با سایر گروه‌های بیماران مبتلا به FA، سطوح بسیار بالایی از شکستگی پایه و صور فلکی غیرعادی از ناهنجاری‌ها دارند . شکستگی پایه همچنین ممکن است به تشخیص افتراقی سایر اختلالات ناپایداری کروموزومی که انواع خاصی از ناهنجاری‌های کروموزومی را نشان می‌دهند، مانند بازآرایی کروموزوم‌های 7 و/یا 14، که معمولاً در آتاکسی تلانژکتازی و سندرم شکستگی نایمگن رخ می‌دهند، کمک کند. بازآرایی تلومر، که اغلب در دیسکراتوز مادرزادی رخ می دهد. و جدایی زودرس سانترومر، که مشخصه سندرم رابرتز و سندرم شکستگی ورشو است. در نهایت، اگر شکستگی بر روی آماده‌سازی‌های کروموزوم باند G ارزیابی شود، می‌توان ناهنجاری‌های کروموزومی را که ممکن است تشخیصی جایگزین برای یافته‌های بالینی بیمار ارائه دهد، رد کرد. موارد اخیر در حدود 1-2٪ از بیمارانی که برای رد FA مراجعه می کنند، ثبت شده است.
تجزیه و تحلیل چرخه سلولی در لنفوسیت های خون محیطی
تجزیه و تحلیل شکست کروموزوم ناشی از میتومایسین C و/یا DEB رایج ترین آزمایش خط اول برای تشخیص FA است. با این حال، چند آزمایشگاه سینتیک چرخه سلولی، به جای شکستن کروموزوم، در لنفوسیت های خون محیطی تحت درمان با میتوژن و عوامل پیوند متقابل DNA را اندازه گیری می کنند [26، 27]. لنفوسیت های طبیعی که هیچ آسیبی به DNA ندارند در تمام مراحل طبیعی چرخه سلولی بدون تاخیر قابل توجهی پیشرفت می کنند. با این حال، سلول هایی که آسیب DNA دارند، قبل از اینکه به فاز M بروند، در مرحله S/G2 چرخه توقف می کنند تا آسیب را ترمیم کنند. از آنجایی که سلول‌های FA پس از درمان با عوامل اتصال عرضی DNA آسیب ترمیم‌نشده بیشتری دارند، درصد بالاتری از سلول‌ها (معمولاً 40٪ یا بیشتر) از بیماران FA در مقایسه با سلول‌های افراد بدون FA در مرحله S/G2 متوقف می‌شوند. برخی از آزمایشگاه ها ممکن است از تجزیه و تحلیل چرخه سلولی همراه با آزمایش شکست کروموزوم برای اهداف تحقیقاتی استفاده کنند. اگرچه تجزیه و تحلیل چرخه سلولی در حال حاضر در محیط بالینی استفاده نمی شود، اصول و نمودار جریان مشخص شده برای آزمایش شکست کروموزوم باید اعمال شود. نتایج مثبت، منفی و مبهم باید همانطور که برای نتایج آزمایش شکست کروموزوم در شکل 1 توضیح داده شده است دنبال شود.

تفسیر نتایج آزمایش شکست کروموزوم
اگرچه شکستن کروموزوم استاندارد طلایی برای تشخیص FA در نظر گرفته می شود، اما هنوز این احتمال وجود دارد که نتیجه آزمایش مثبت کاذب باشد (آزمایش مثبت است اما بیمار FA ندارد) یا نتیجه آزمایش منفی کاذب باشد (آزمایش نتیجه منفی می دهد اما بیمار FA دارد). برای تفسیر نتایج آزمایشگاهی، تعیین محدوده کنترل مثبت و منفی توسط آزمایشگاه بسیار مهم است. برای تعیین این محدوده‌ها، آزمایشگاه باید تعداد کافی بیمار (معمولاً 30 یا بیشتر) را با تشخیص تأیید شده FA آزمایش کرده باشد. شرایطی که ممکن است نتیجه آزمایش منفی یا مثبت کاذب داشته باشد در بخش های زیر توضیح داده شده است.

نتیجه آزمایش مثبت،
اگر لنفوسیت‌ها پس از درمان با MMC و/یا DEB به طور قابل توجهی شکستگی کروموزومی و بازآرایی را در مقایسه با شکستگی پایه‌شان افزایش دهند، آزمایش FA مثبت در نظر گرفته می‌شود. به طور معمول، بیش از 90 درصد سلول‌های متافازی که در کشت تیمار شده با MMC یا DEB از یک فرد مبتلا به FA مورد بررسی قرار می‌گیرند، شکستگی بیشتری را نشان می‌دهند، و میزان و انواع شکستگی مشاهده‌شده در محدوده تعیین‌شده FA آزمایشگاه قرار می‌گیرد. پس از نتیجه مثبت، یک مشاور ژنتیک می تواند به هماهنگی پیگیری های لازم کمک کند. مهمتر از همه، آزمایشات بعدی باید برای شناسایی نوع(های) بیماریزای بیمار با استفاده از روشهای مولکولی شرح داده شده در این فصل انجام شود.

در برخی موارد، تشخیص FA ممکن است تنها پس از تشخیص سرطان در فرد، مانند سرطان خون یا تومور جامد، مشکوک باشد. پزشک ممکن است به FA مشکوک باشد زیرا این بیمار عوارض جانبی شدیدی را از درمانی که برای درمان سرطان انجام می شود تجربه می کند. ارزیابی آزمون شکست کروموزومی MMC و DEB ضروری است.

نتیجه آزمایش منفی
اگر سلول های متافاز از کشت تیمار شده با MMC یا DEB افزایش شکستگی کروموزومی یا بازآرایی را نشان ندهند، و اگر میزان شکست مشاهده شده در محدوده نرمال آزمایشگاهی باشد، نتیجه آزمایش منفی تلقی می شود. اگر تست شکست کروموزوم منفی باشد و شواهد بالینی مبنی بر اینکه بیمار ممکن است FA ضعیف باشد، نیازی به مطالعات بیشتری نیست. در مقابل، اگر آزمایش شکست کروموزوم منفی باشد، اما شواهد بالینی قوی وجود داشته باشد که ممکن است بیمار مبتلا به FA باشد، آزمایش فیبروبلاست پوست باید انجام شود تا احتمال موزائیسم سوماتیک را رد کند، همانطور که در زیر توضیح داده شده است. علاوه بر این، اختلالات متعددی وجود دارد که برخی از ویژگی های بالینی مشترک با FA دارند و با نوعی ناپایداری کروموزوم همراه هستند [20-25]. بنابراین، بیمارانی که تست شکست کروموزوم منفی دارند، باید توسط یک سرویس ژنتیک بالینی ارزیابی شوند زیرا ممکن است آزمایش ژنتیکی اضافی لازم باشد.

نتیجه آزمایش مبهم
اگر درصد سلول هایی که الگوهای شکست کروموزومی مشخصه FA را نشان می دهند کمتر از آنچه آزمایشگاه معمولاً برای FA مشاهده می کند باشد، یا اگر شکستگی افزایش یافته باشد اما انواع شکستگی مشخصه FA نباشد، نتایج آزمایش مبهم یا غیر قطعی در نظر گرفته می شود. میانگین تعداد شکست در هر سلول ممکن است بالاتر از حد بالایی محدوده کنترل نرمال باشد، اما کمتر از حد پایینی محدوده FA آزمایشگاه است. علل زمینه‌ای نتایج غیرقطعی شامل موزائیسم در سلول‌های خون محیطی بیمار، تغییرات هیپومورفیک و احتمال ابتلای بیمار به شرایطی غیر از FA است که با افزایش شکستگی کروموزومی خود را نشان می‌دهد.

موزائیسم در سلول‌های خون محیطی
موزاییک سوماتیک می‌تواند در لنفوسیت‌های T و سلول‌های بنیادی خونساز به دلیل برگشت یک نوع ارثی در ژن FA رخ دهد. اگر شواهد بالینی مبنی بر اینکه بیمار ممکن است FA قوی باشد، اما نتایج آزمایش شکست کروموزوم خون محیطی منفی یا مبهم گزارش شده باشد، باید آزمایش برای تشخیص موزائیسم انجام شود. موزائیسم را می توان با ارسال نمونه ای از پوست بیمار که از طریق بیوپسی پوست به دست آمده به آزمایشگاه سیتوژنتیک بالینی تایید شده، که می تواند آزمایش شکست کروموزوم MMC/DEB را روی سلول های فیبروبلاست انجام دهد، تشخیص داد. تشخیص FA را می توان با آزمایش شکست کروموزوم تأیید کرد که نشان دهنده افزایش شکستگی در فیبروبلاست ها، با انواع شکستگی ها و بازآرایی های مشخصه FA است. تقریباً 10 تا 20 درصد از بیماران مبتلا به FA نوعی موزائیسم دارند که در آن کشت های فیبروبلاست افزایش شکستگی را نشان می دهند، در حالی که لنفوسیت ها این گونه نیستند. درصد سلول های طبیعی در خون این بیماران ممکن است از کمتر از 50 تا 100 درصد متغیر باشد. با گذشت زمان، یک بیمار با درصد کم سلول های طبیعی ممکن است درصد بالایی از سلول های طبیعی ایجاد کند و این روند ممکن است با بهبود خود به خود در تعداد سلول های خونی بیمار همراه باشد. با این حال، موزائیسم اندازه‌گیری شده در لنفوسیت‌های خون محیطی ممکن است منعکس‌کننده موزائیسم در سلول‌های مغز استخوان نباشد. این بدان معنی است که یک بیمار با درصد بالایی از سلول های طبیعی در لنفوسیت های آزمایش شده ممکن است هیچ (یا درصد بسیار کمی از) سلول های طبیعی در مغز استخوان خود نداشته باشد. از آنجایی که سلول های مغز استخوان در ایجاد لوسمی نقش دارند، وضعیت آنها نباید از نتایج لنفوسیت ها تعمیم یابد. آزمایش مستقیم سلول‌های مغز استخوان با استفاده از همان تست‌های شکست کروموزوم مورد استفاده برای لنفوسیت‌ها امکان‌پذیر نیست. بنابراین، مشخص نیست که آیا سیر بالینی بیماری در بیمارانی که سلول‌های طبیعی در خون محیطی دارند، تغییر خواهد کرد یا خیر. نکته مهم این است که وجود موزائیسم – چه در خون و چه در مغز استخوان – از فرد در برابر ایجاد ناهنجاری‌های کروموزوم کلونال در جمعیت سلول‌هایی که گونه‌های ژن FA خود را حفظ می‌کنند، محافظت نمی‌کند، که ممکن است منجر به ایجاد بدخیمی‌های خونی شود. علاوه بر این، موزائیسم در خون یا مغز استخوان نیز در برابر ایجاد تومورهای جامد محافظت نمی کند.

Example reporting of Fanconi  ISCN Result: 46,XY[20]

 Chromosome Instability Studies: Spontaneous Chromosome Breakage=0.20 breaks/cell Abnormal resul Normal range=0–0.12 breaks/cell DEB Stress Test=12.1 breaks/cell Abnormal res Normal range=0–0.18 breaks/cell Interpretatio Cytogenetics analysis revealed a normal male chromosome complement in all 20 cells  analyzed with a routine cytogenetic study. Chromosome instability studies with a PHA-mitogen stimulated lymphocyte (unstresse culture showed 0.20 spontaneous breaks per cell. The spontaneous chromosome breakage in Fanconi anemia (FA) patients ranges from 0.02 to 0.85 breaks per cell Also, diepoxybutane (DEB) testing is diagnostic for FA in patients with subtle feature PHA-mitogen stimulated lymphocyte culture stressed with 0.1µg/mL of DEB showed 1 breaks per cell. The DEB stress test in FA patients ranges from 1.10 to 23.9 breaks per ce These results are consistent with a diagnosis of Fanconi anemia. Although the DEB test  highly specific for the diagnosis of FA, it does not distinguish between heterozygous carriers or define the specific FA complementation group

Sider Fusion

این متن درباره نتایج آزمایش‌های مربوط به بیماری فنکونی (Fanconi anemia) است. در اینجا توضیحات کلیدی آمده است:

1. اطلاعات کروموزومی:
   • گزارش نشان می‌دهد که در آزمایش‌های کروموزومی (ISCN)، تعداد 20 سلول بررسی شده است و همه آنها ترکیب کروموزومی نرمال (46,XY) را نشان می‌دهند.
2. مطالعات ناپایداری کروموزومی:
   • تجزیه و تحلیل شکست کروموزومی خودبخودی: در این آزمایش، تعداد شکست‌های خودبخود کروموزومی 0.20 شکست در هر سلول ثبت شده که بیشتر از دامنه نرمال (0–0.12 شکست در هر سلول) است. معمولاً در بیماران مبتلا به فنکونی، شکست‌های خودبخود کروموزومی از 0.02 تا 0.85 شکست در هر سلول متغیر است.
   • آزمایش استرس DEB: در این آزمایش، تعداد شکست‌ها 12.1 شکست در هر سلول گزارش شده که این هم بیشتر از دامنه نرمال (0–0.18 شکست در هر سلول) است. در بیماران فنکونی، تعداد شکست‌ها معمولاً بین 1.10 تا 23.9 شکست در هر سلول است.
3. تفسیر نتایج:
   • بر اساس نتایج، وجود ناپایداری کروموزومی نشان می‌دهد که این نتایج با تشخیص فنکونی انمی همخوانی دارد.
   • آزمایش DEB به طور خاص برای تشخیص فنکونی انمی طراحی شده است، اما نمی‌تواند بین حاملین هتروزیگوت و تعیین گروه‌های مکمل فنکونی تمایز قائل شود.