۱. فیکساسیون بلاستومر چیست؟
فیکساسیون، مرحلهای است که طی آن سلول بلاستومر (blastomere) پس از جداسازی، بهصورت پایداری روی لام قرار میگیرد تا:
- ساختار هسته حفظ شود
- دسترسی کروماتین برای FISH یا سایر روشهای مولکولی فراهم شود
- از لیز شدن یا تخریب هسته جلوگیری شود
- اسلاید برای هیبریداسیون پروب آماده شود
فیکس مناسب = سیگنال واضح، پسزمینه کم، هسته سالم و قابل شمارش.
۲. مراحل کلی (غیرعملیاتی) فیکساسیون بلاستومر
بهصورت کلی و مفهومی:
- جداسازی بلاستومر
سلول تحت میکروسکوپ از جنین ۶–۸ سلولی جدا میشود. - انتقال بلاستومر به لام
سلول در حداقل حجم منتقل میشود تا تغییر شکل ندهد. - لیز ملایم و پراکندگی کروماتین
این مرحله در فیکساسیون PGD بسیار مهم است.
هدف، باز شدن ملایم غشاء و حفظ کروماتین در مرکز سلول است. - افزودن فیکساتور (Fixative)
فیکساتور (معمولاً بر پایهٔ الکلها) باعث تثبیت ساختار کروماتین و از بین رفتن چربیهای غشایی میشود. - خشک شدن کنترلشده
خشک شدن سریع یا آهسته به پروتکل آزمایشگاه بستگی دارد.
کیفیت این مرحله تعیینکنندهٔ کیفیت نهایی FISH است. - کنترل کیفیت اسلاید
هسته باید:- گرد
- واضح
- بدون تَرَک
- بدون over-spreading یا under-spreading
باشد.
۳. انواع روشهای فیکساسیون بلاستومر
در دنیا سه دسته روش رایج وجود دارد:
الف) روش کلاسیک (Methanol–Acetic Acid Based Fixation)
رایجترین روش جهانی برای FISH بلاستومر.
ویژگیها:
- سازگار با تمام پروبهای X/Y و اتوزوم
- آسان برای استانداردسازی
- نتیجهٔ قابلپیشبینی
- مقاومت نسبی در برابر over-fixation
این روش دهههاست توسط Mayo Clinic، Johns Hopkins، ESHRE، و ASRM توصیه شده است.
ب) روش الکلهای دوگانه یا چندمرحلهای (Alcohol Layer Fixation)
در برخی آزمایشگاههای اروپایی استفاده میشود.
مزایا:
- هسته بسیار صاف
- پسزمینهٔ کمتر
کاربرد:
- FISH چندرنگه (Multiplex FISH)
- PGT-SR و PGT-A در برخی مراکز پژوهشی
ج) روشهای مبتنی بر لیز شیمیایی کنترلشده
(Detergent Assisted Fixation)
در این روش ابتدا غشاء سلول با دترجنت (غیر یونی) تضعیف شده و سپس فیکشن انجام میشود.
مزایا:
- افزایش نفوذپذیری کروماتین
- مناسب برای پروبهای بزرگتر
معمولاً در روشهای اصلاحشدهٔ FISH و نیز Oligo-FISH کاربرد دارد.
۴. روش استاندارد و مرسوم بینالمللی
برای PGT-SR، PGT-M و تعیین جنسیت (Sex Selection / Sex-Linked Disease Testing) هنوز هم:
روش استاندارد: فیکساسیون مبتنی بر Methanol–Acetic Acid
به توصیهٔ:
- ESHRE PGD Consortium Best Practice Guidelines
- ASRM Practice Committee
- Mayo Clinic Cytogenetics Division
- Stern and Ginsburg: Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis
- Gardner & Weissman: In Vitro Fertilization Textbook
این روش بیشترین reproducibility و کمترین آرتیفکت را دارد.
۵. رفرنسهای معتبر برای مطالعهٔ روشها
کتابها:
- Gardner, Weissman, Howles – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
- Stern, Verlinsky – Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis
- Bui & Harper – Preimplantation Genetic Testing Handbook (2022)
- Liehr T. – FISH in Clinical Diagnosis, 2nd Ed.
گایدلاینها:
- ESHRE PGT Consortium Guidelines 2019–2023
- ASRM Committee Opinion on PGT
- ACMG Technical Standards for FISH
۶. روشهای جدید تعیین جنسیت (PGT-Sex Determination) از بلاستومر
در حال حاضر، FISH تنها یکی از روشهاست. روشهای جدیدتر دقیقتر و کاملاً جایگزین FISH شدهاند.
۱. تعیین جنسیت به روش qPCR آنی (Realtime-PCR)
- سرعت بسیار بالا
- قابل استفاده روی یک سلول
- خطای کمتر از FISH
- امکان تشخیص ژنهای وابسته به X (مثل DMD)
۲. تعیین جنسیت با Next-Generation Sequencing (NGS-Based PGT-A)
استاندارد طلایی فعلی دنیا
مزایا:
- تعیین جنسیت با دقت تقریباً ۱۰۰٪
- بررسی کل کروموزومها
- تشخیص موزایسم
- تشخیص microdeletions
- مناسب برای PGT-A و PGT-SR
NGS اکنون روش استاندارد در:
Cleveland Clinic – Mayo Clinic – Cornell – UCL – Shady Grove – CCRM
۳. تعیین جنسیت با SNP-Array / Karyomapping
- امکان تشخیص بیماریهای وابسته به جنس
- ردیابی هاپلوتایپهای مادری/پدری
- مناسب PGT-M برای بیماریهای X-Linked
۴. تعیین جنسیت با Oligo-FISH نسل جدید
(نادر، پژوهشی، دقت بهتر از FISH کلاسیک)
۷. نتیجهگیری
- فیکساسیون بلاستومر بخشی حساس از PGT است و روش Methanol–Acetic Acid هنوز روش استاندارد جهانی است.
- روشهای دیگر وجود دارند اما یا پژوهشیاند یا برای کاربردهای خاص.
- امروزه تعیین جنسیت با NGS نسبت به FISH بسیار دقیقتر، سریعتر و استانداردتر است و در بهترین مراکز دنیا جایگزین شده است.
دیدگاه خود را بنویسید