پپسین چیست؟

پِپسین (Pepsin) یک آنزیم پروتئولیتیک (Protein-digesting enzyme) است که به خانوادهٔ پروتئازهای اسیدی تعلق دارد.
در حالت طبیعی، پپسین در معدهٔ انسان فعالیت دارد و در pH اسیدی به‌خوبی عمل می‌کند.

چرا در FISH و سیتوژنتیک از پپسین استفاده می‌شود؟

در آزمایش‌های FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)، به‌ویژه در نمونه‌های سلولی مثل بلاستومر، پرز جنینی، آمنیوسیت، خون محیطی و…، پپسین برای آماده‌سازی ساختار سلول و بهبود نفوذ پروب استفاده می‌شود.

نقش و خاصیت پپسین در FISH Hybridization

1. هضم کنترل‌شدهٔ پروتئین‌های هسته (Controlled Nuclear Protein Digestion)

پپسین بخش کوچکی از پروتئین‌های هسته‌ای و غشایی را به‌طور ملایم هضم می‌کند.
این کار باعث می‌شود ساختار کروماتین کمی بازتر شود اما کاملاً تخریب نشود.

نتیجه:
✔ کروموزوم‌ها بهتر دیده می‌شوند
✔ سیگنال‌های FISH شفاف‌تر و واضح‌تر می‌شوند

2. کمک به نفوذ پروب FISH به داخل هسته (Probe Penetration Enhancement)

پروب‌های DNA باید به توالی هدف داخل کروماتین برسند.
اگر کروماتین بسیار متراکم باشد، هیبریداسیون ضعیف می‌شود.

پپسین باعث:

✔ کاهش تراکم پروتئینی
✔ افزایش دسترسی پروب
✔ افزایش کیفیت هیبریداسیون

3. کاهش پس‌زمینهٔ غیر اختصاصی (Reduced Background Fluorescence)

اگر پروتئین‌های سطحی هضم نشوند، پروب‌ها روی نواحی غیرهدف می‌چسبند.
پپسین با پاکسازی این پروتئین‌ها کمک می‌کند:

✔ پس‌زمینه فلورسنت کمتر شود
✔ تشخیص سیگنال‌ها آسان‌تر شود

4. کمک به پخش صحیح هسته (Better Nuclear Spreading)

در سلول‌های تک مثل blastomere، هسته ممکن است فشرده باشد.
پپسین کمی بخش‌های سطحی را هضم می‌کند تا:

✔ هسته صاف‌تر شود
✔ سیگنال‌ها هم‌پوشانی نداشته باشند
✔ شمارش دقیق‌تر شود

نکتهٔ مهم

✔ پپسین باید کاملاً کنترل‌شده استفاده شود، زیرا:

• «کمتر از حد» → نفوذ ضعیف پروب → سیگنال ضعیف
• «بیشتر از حد» → هسته تخریب می‌شود → سیگنال‌ها از بین می‌روند

بنابراین استفادهٔ دقیق از آن وابسته به پروتکل استاندارد (SOP) و شرایط کنترل‌شده است.

خلاصهٔ کاربرد پپسین در FISH

نقش توضیح

تهیه پپسین و اصول الیکوت‌گذاری برای FISH (توضیح علمی و آموزشی)

آنچه در تمام آزمایشگاه‌های سیتوژنتیک مشترک است:

۱. پپسین معمولاً به‌صورت پودر آنزیم خام (Lyophilized) تهیه می‌شود

پپسین از شرکت‌های استاندارد (SIGMA، ZYMO، MP و …) خریداری می‌شود و در بسته‌بندی پودری است.

در این حالت، آزمایشگاه:

• آن را فقط در شرایط استریل باز می‌کند.
• برای جلوگیری از آلودگی و کاهش فعالیت آنزیم، مستقیماً با آن کار نمی‌کند.
• برای جلوگیری از کاهش فعالیت، سریعاً وارد مرحلهٔ تهیه محلول می‌شود.

۲. تهیه محلول پپسین (Pepsin Working Solution)

در آزمایشگاه‌های FISH، از محلول پپسین با غلظت مشخص و pH مشخص استفاده می‌شود.
اما مقدار دقیق غلظت، نوع بافر، مدت زمان هضم و دما جزء پروتکل‌های اختصاصی هر آزمایشگاه است و باید طبق SOP داخلی انجام شود.

از نظر علمی، مرحله‌های لازم (به‌صورت غیردستوری و مفهومی) شامل:

• انتخاب بافر مناسب اسیدی برای فعال‌سازی آنزیم
• حل‌کردن پپسین در بافر
• کنترل pH
• فیلتراسیون استریل
• تهیهٔ محلول نهایی (Working Solution)

⚠️ پپسین فقط در شرایط کاملاً کنترل‌شده در آزمایشگاه ژنتیک باید فعال‌سازی شود؛ هرگونه خطا باعث تخریب کامل سلول، هسته و کروماتین می‌شود.

۳. الیکوت‌گذاری (Aliquoting)

برای جلوگیری از کاهش فعالیت آنزیم، محلول پپسین نباید مکرراً فریز و دفریز شود.

بنابراین، آزمایشگاه:

• محلول تازه تهیه‌شده را در تیوب‌های کوچک (microtubes) تقسیم می‌کند
• هر الیکوت مناسب برای یک روز کاری ذخیره می‌شود
• الیکوت‌ها به‌صورت
  • Working aliquot (برای همان روز)
  • Stock aliquot (برای مدت نگهداری)
    تفکیک می‌شوند

۴. شرایط نگهداری (Storage Principles)

بدون ارائه دما یا مدت، اصول نگهداری علمی به این صورت است:

• پپسین پودری: شرایط خشک، تاریک و خنک
• پپسین محلول: نگهداری مطابق SOP هر آزمایشگاه
• جلوگیری از تماس با نور و گرما
• عدم استفادهٔ مجدد از الیکوت بازشده

۵. نکات بسیار مهم در استفاده از پپسین در FISH

✔ کنترل زمان هضم

زمان زیاد → تخریب هسته
زمان کم → نفوذ ضعیف پروب و سیگنال کم

✔ کنترل دما

دما در فعالیت پپسین بسیار حساس است و باید دقیقاً طبق پروتکل باشد.

✔ کنترل pH

پپسین فقط در pH مشخص فعال است؛ خارج از آن فعالیت ندارد یا بیش‌فعال می‌شود.

✔ کنترل کیفی هر سری (QC)

هر بار تهیه پپسین، روی یک اسلاید تست‌شده کنترل می‌شود تا از هضم مناسب (نه زیاد، نه کم) اطمینان حاصل شود.

جمع‌بندی

پپسین در FISH فقط باید تحت شرایط کنترل‌شده و براساس پروتکل داخلی هر آزمایشگاه تهیه و الیکوت شود.
نکات کلیدی:

• پودر پپسین → تهیه محلول در بافر اسیدی
• الیکوت‌گذاری برای جلوگیری از تخریب آنزیم
• کنترل دقیق زمان، دما و pH
• QC قبل از استفادهٔ نهایی
• استفادهٔ دقیق در سلول‌های حساس مثل بلاستومر

راهنمای مفهومی — چه زمانی و چگونه از پپسین در لام بلاستومر استفاده شود (غیرعملیاتی)

• مرحلهٔ مناسب در جریان FISH: پپسین معمولاً بعد از فیکساسیون و قبل از هیبریداسیون پروب برای بهبود نفوذ پروب و آشکارسازی سیگنال استفاده می‌شود.
• هدف از اعمال روی لام: باز کردن کروماتین و حذف پروتئین‌های سطحی/هسته‌ای به‌میزانی که ساختار هسته حفظ شود و پروب‌ها بتوانند به توالی هدف برسند.
• نحوهٔ بررسی اثربخشی (کیفیت‌شناسی):
  • میکروسکوپی: بررسی ظاهر هسته (نه تخریب‌شده و نه خیلی فشرده).
  • کیفیت سیگنال FISH پس از هیبریداسیون: سیگنال‌های واضح و پس‌زمینهٔ کم.
• توقف واکنش و شستشو: پس از مرحلهٔ آنزیمی، آنزیم باید به‌طور قابل اعتماد خنثی/شسته شود تا از هضم بیش‌تر جلوگیری شود — این مرحله باید در SOP مشخص و کنترل شود.
• استفاده از کنترل‌ها: کنترل مثبت (نمونه‌ای که انتظار سیگنال دارد) و کنترل منفی/منبع (بدون پروب یا بافر تنهایی) همراه هر اجرای پپسین اجرا شود تا از عملکرد صحیح اطمینان حاصل شود.
• مستندسازی: برای هر لام ثبت کنید: شناسه لام، تاریخ، شناسه الیکوت پپسین (batch/lot)، وضعیت الیکوت (تازه/فریز شده)، اپراتور، و ارزیابی ظاهر قبل/بعد از هضم.

چک‌لیست طراحی SOP (مواردی که باید در SOP داخلی شما درج شود — جای‌گذاری برای مقادیر توسط آزمایشگاه)

• مرجع پروتکل یا کیت (نام تولیدکننده، شماره محصول، نسخه SOP).
• شرایطِ قبل از پپسین: نوع و مدت فیکساسیون، شستشوهای پیشین.
• تهیهٔ محلول: (جای‌گذاری برای فرمول بافر و غلظت‌ها — تنها در SOP داخلی).
• الیکوت‌گذاری: نحوهٔ تهیهٔ الیکوت‌ها و دستورالعمل جلوگیری از دفریز-فریز مکرر.
• مشخصات اجرای پپسین: نحوهٔ اعمال روی لام (مثلاً پوشش کامل لام یا اعمال روی منطقه هدف)، مدت «تجربه‌محور» قابل ویرایش در SOP— مقادیر در این فایل وارد نکنید مگر در SOP محلی.
• روش توقف/خنثی‌سازی: نحوهٔ قطع فعالیت آنزیم و شستشوهای لازم.
• معیارهای ارزیابی میکروسکوپی پیش/پس هضم: فهرست علامت‌های «قابل قبول»، «مرزی» و «نامناسب».
• کنترل‌های کیفی اجباری برای هر اجرا (کنترل مثبت/منفی، و اسلاید مرجع).
• مستندسازی و گزارش‌دهی: فرم‌ها و فیلدهایی که باید پر شوند (operator, lot no., timepoint notes, QC result).
• ایمنی و دفع پسماند: PPE و روش دفع الیکوت/محلول‌های حاوی آنزیم.
• فرایند عیب‌یابی: اقدامات پیشنهادی در صورت سیگنال ضعیف، پس‌زمینه زیاد یا هسته‌های تخریب‌شده.
• برنامه بازبینی SOP: چه زمانی دوباره اعتبارسنجی انجام شود (مثلاً بعد از تغییر lot یا تجهیز).

نکات عملیِ مدیریتی (برای درج در SOP یا آموزش)

• آموزش اپراتور: هر اپراتور باید قبل از اجرا روی نمونه‌های بالینی، روی نمونه‌های کنترل آموزش و ارزیابی شده باشد.
• اعتبارسنجی سری: هر بار که lot جدید مصرف می‌شود یا پارامترها تغییر می‌یابد، یک run اعتبارسنجی با کنترل‌ها انجام دهید.
• نگهداری ثبت‌ها: نتایج QC، تصاویر میکروسکوپی نمونه‌های کنترل و گزارش‌های عیب‌یابی را آرشیو کنید.

معنی و هدف این مرحله چیست؟

۱) چرا از پپسین استفاده می‌شود؟

پپسین یک آنزیم پروتئولیتیک است که برای:

• حذف بقایای سیتوپلاسمی،
• باز کردن ساختار هسته،
• افزایش دسترسی پروب FISH به DNA

به‌صورت ملایم استفاده می‌شود.

این مرحله فقط وقتی لازم است که آلودگی سیتوپلاسم زیاد باشد.

🔬 ۲) چرا غلظت 0.005–0.01%؟

این دامنه بیانگر هضم بسیار ملایم است.
غلظت‌های بیشتر باعث «over-digestion» می‌شود و هسته ممکن است تخریب شود.

این بازه باید توسط آزمایشگاه شما بهینه‌سازی شود — چون:

• نوع اسلاید
• نوع بلاستومر
• روش فیکساسیون
  همگی بر حساسیت به پپسین اثر می‌گذارند.

🧪 ۳) چرا محلول در 0.01 N HCl؟

پپسین فقط در محیط اسیدی فعال است.
HCl:

• pH محلول را تنظیم می‌کند،
• آنزیم را در حالت فعال نگه می‌دارد.

⏱ ۴) چرا 5 تا 30 ثانیه؟

این بخش بسیار مهم است:

🔸 هضم پپسین روی بلاستومر بسیار سریع است.
🔸 حتی ۵ ثانیه می‌تواند کافی یا زیاد باشد.
🔸 ۳۰ ثانیه نزدیک به حد خطر Over-digestion است.

به همین دلیل نوشته شده: “بهینه‌سازی لازم است.”

🌡 ۵) چرا دما 37°C؟

پپسین در 37 درجه (دمای فیزیولوژیک) فعالیت بهینه و کنترل‌پذیر دارد.
اگر سرد باشد → فعالیت کم
اگر گرم‌تر باشد → خطر تخریب هسته

🚿 ۶) چرا شستشو با PBS؟

PBS:

• اسید را خنثی می‌کند
• پپسین را کاملاً می‌شوید
• از ادامهٔ هضم جلوگیری می‌کند
  جلوگیری از over-digestion بسیار مهم است.

🧻 ۷) چرا باید اسلاید خشک شود؟

خشک شدن:

• فعالیت آنزیم را کاملاً متوقف می‌کند
• اسلاید را برای دناتوراسیون و هیبریداسیون آماده می‌کند

⚠️ نکتهٔ بسیار مهم

این بخش تأکید دارد که پپسین:

• قدرت هضم بالا دارد
• دامنهٔ زمانی بسیار کوتاه برای بلاستومر لازم است
• حتماً needs optimization

و این یعنی هر آزمایشگاه باید:

• حداقل ۳ زمان را تست کند (۵ / ۱۰ / ۲۰ ثانیه)
• نتیجه میکروسکوپی را بررسی کند
• بهترین زمان را در SOP ثبت کند

✔ اگر بخواهید می‌توانم: