دستورالعمل اجرایی مولکولی
دستورالعمل اجرایی پذیرش (ژن های طلایی )
بیماران و نمونهها در بخشهای ژنتیک مولکولی، FISH و NGS
- صفحه 1 از 8
- عنوان سند
- کد سند: MOL-GEN-002
- نسخه: 1.0
- تاریخ اجرا: 1404/04/20
- تدوین: گروه ژنهای طلایی
1. هدف
هدف از این دستورالعمل، تعریف و استانداردسازی مراحل پذیرش بیماران، جمعآوری، نگهداری و ارزیابی نمونهها در بخشهای ژنتیک مولکولی، FISH و توالییابی نسل جدید (NGS) است تا از کیفیت DNA/RNA، دقت نتایج و قابلیت بازتولید اطمینان حاصل گردد.
2. دامنه کاربرد
این دستورالعمل در بخشهای زیر اجرا میشود:
- بخش ژنتیک مولکولی (PCR، Real-time PCR، MLPA، Sanger)
- بخش FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
- بخش NGS (Next Generation Sequencing)
3. مسئولیتها
سمت مسئولیت
| کارشناس پذیرش | بررسی مدارک، احراز هویت و ثبت اطلاعات در LIS |
| کارشناس نمونهگیری | جمعآوری نمونه با رعایت شرایط استریل و برچسبگذاری صحیح |
| کارشناس مولکولی | کنترل کیفیت نمونه، استخراج DNA/RNA و ثبت در فرم کنترل کیفیت |
| سرپرست بخش ژنتیک | نظارت بر کلیه مراحل و تأیید نهایی پذیرش یا رد نمونه |
4. مراحل اجرایی
4-1. احراز هویت بیمار
- بررسی کارت ملی یا شناسنامه بیمار.
- تطبیق اطلاعات شناسایی با فرم درخواست پزشک.
- اطمینان از درج نوع تست، تشخیص بالینی و امضای پزشک.
- در تستهای خانوادگی، هویت تمام اعضای خانواده باید احراز گردد.
- دریافت فرم رضایت آگاهانه ژنتیک قبل از نمونهگیری الزامی است.
صفحه 3 از 8
4-2. انواع نمونههای مورد پذیرش
نوع آزمایش نوع نمونهحجم مورد نیازشرایط نگهداریزمان مجاز ارسال
| PCR / Sanger | خون EDTA | 2–5 ml | ۴–۸°C | تا 72 ساعت |
| MLPA | خون EDTA | 3 ml | ۴–۸°C | تا 72 ساعت |
| RNA-based PCR | خون در لوله PAXgene / EDTA | 2–5 ml | ۴–۸°C | تا 24 ساعت |
| FISH (خون / مغز استخوان) | خون هپارینه / مغز استخوان | 1–2 ml | دمای اتاق | تا 24 ساعت |
| FISH (بافت / آمنیون) | بافت تازه در RPMI | حدود 1 cm³ | ۴–۸°C | تا 24 ساعت |
| NGS (Whole Exome / Target Panel) | خون EDTA یا DNA استخراجشده | 3–5 ml یا ≥ 50 ng DNA | ۴–۸°C | تا 72 ساعت |
| cfDNA (Prenatal / Oncology) | پلاسما جداشده در لوله cfDNA | 2–4 ml | ۴°C | تا 24 ساعت |
4-3. برچسبگذاری و فرم درخواست
✅ روی هر نمونه باید موارد زیر درج گردد:
- نام و نام خانوادگی بیمار
- کد ملی / شماره پرونده
- نوع نمونه و تاریخ نمونهگیری
- نام کارشناس نمونهگیر
✅ فرم درخواست باید شامل موارد زیر باشد:
- مشخصات کامل بیمار و پزشک
- نوع تست درخواستی (PCR, FISH, NGS, ...)
- تشخیص بالینی
- در تستهای ارثی: مشخصات اعضای خانوادهی درگیر
- تاریخ نمونهگیری و امضای پزشک
صفحه 4 از 8
4-4. شرایط نگهداری و ارسال نمونهها
نوع نمونهشرایط نگهدارینحوه ارسال
| خون EDTA | ۴–۸°C (در یخچال) | درون جعبه حمل نمونه با بسته یخ غیرمستقیم |
| DNA استخراجشده | در فریزر -20°C | در بستهبندی مقاوم با کنترل دما |
| بافت تازه | در محلول RPMI یا سرم فیزیولوژی استریل | در ۴–۸°C و طی ۲۴ ساعت |
| مایع آمنیوتیک | دمای اتاق، بدون تماس مستقیم با یخ | در ظرف استریل با درب محکم |
| پلاسما cfDNA | در دمای ۴°C | ارسال در کمتر از 24 ساعت |
⚠️ توجه:
- از فریز و ذوب مکرر نمونهها باید جلوگیری شود.
- از تماس مستقیم با یخ یا گرما خودداری گردد.
- در نمونههای DNA استخراجشده، غلظت و خلوص باید پیش از ارسال ثبت شود (A260/280: 1.8–2.0).
صفحه 5 از 8
4-5. معیارهای رد نمونه
علت رد نمونهتوضیح / مثال
| برچسب ناقص یا اشتباه | اطلاعات نمونه با فرم تطابق ندارد |
| لخته شدن خون EDTA | مانع استخراج DNA با کیفیت |
| آلودگی میکروبی | نمونه دارای بوی غیرطبیعی یا کدورت |
| فریز و ذوب مکرر | منجر به تخریب DNA |
| حجم ناکافی | کمتر از 1 ml خون یا کمتر از 20 ng DNA |
| نشت یا آسیب در ظرف | خطر آلودگی یا از دست رفتن نمونه |
| DNA با غلظت پایین یا A260/280 خارج از محدوده | نشاندهنده آلودگی یا تخریب نمونه |
| نمونه از منبع نامناسب (فرمالین فیکس شده) | DNA غیرقابل استفاده برای PCR/NGS |
| تأخیر در ارسال بیش از زمان مجاز | کاهش کیفیت یا تجزیه RNA/DNA |
4-6. مثالهای کاربردی
مثال ۱:
نمونه خون در لوله هپارینه برای PCR ارسال شده است.
→ ❌ رد نمونه (فقط لوله EDTA مناسب است؛ هپارین مهارکننده آنزیم Taq است.)
مثال ۲:
نمونه DNA ارسالشده دارای A260/280 = 1.2 است.
→ ⚠️ پذیرش مشروط؛ احتمال آلودگی با پروتئین، نیاز به خالصسازی مجدد.
مثال ۳:
نمونه FISH آمنیوتیک فریز شده است.
→ ❌ رد نمونه (سلولها از بین رفتهاند؛ هیبریداسیون ممکن نیست).
مثال ۴:
نمونه NGS خون EDTA با تاخیر 3 روزه رسیده ولی در یخچال نگهداری شده است.
→ ✅ قابل قبول، در صورتی که کیفیت DNA تایید شود.
صفحه 6 از 8
4-7. شرایط خاص بخش FISH
- نمونه باید تازه و دارای سلولهای زنده باشد.
- از استفاده از نمونههای فیکسشده یا خشک خودداری گردد.
- در نمونههای آمنیوتیک یا مغز استخوان، بررسی میکروسکوپی اولیه جهت ارزیابی زنده بودن سلولها الزامی است.
- در تستهای FISH روی بلوک پارافینه، باید بافت فاقد نکروز و فرمالین بیش از حد باشد.
- تمامی نمونهها باید دارای کد اختصاصی FISH و ثبت در فرم “FISH Sample Logbook” باشند.
4-8. شرایط خاص بخش NGS
- DNA باید با غلظت حداقل 20 ng/μl و خلوص 1.8–2.0 ارسال شود.
- در تستهای WES یا WGS، باید حداقل 2 µg DNA در دسترس باشد.
- فایل مشخصات نمونه و فرم رضایتنامه باید شامل موارد زیر باشد:
- هدف تست (تشخیصی، پیشازتولد، غربالگری سرطان و...)
- سطح تحلیل (هدفمند، Whole Exome، Whole Genome)
- اجازه یا عدم اجازه برای یافتههای اتفاقی (Incidental Findings)
- در صورت ارسال DNA از مرکز دیگر، نمونه باید همراه با گزارش کیفیت (QC report) باشد.
صفحه 7 از 8
4-9. ثبت، مستندسازی و کنترل کیفیت
- ثبت تمام نمونهها در نرمافزار LIS یا دفتر ثبت مولکولی.
- ثبت دمای حمل در فرم “Log حمل نمونههای مولکولی”.
- ارزیابی کیفیت DNA/RNA قبل از آزمایش (غلظت، خلوص، تمامیت ژل الکتروفورز).
- ثبت دلایل رد یا پذیرش مشروط در فرم مخصوص.
- آموزش سالانه پرسنل در زمینه نمونهگیری، نگهداری و اصول کنترل آلودگی.
4-10. ایمنی زیستی
- استفاده از تجهیزات حفاظت فردی (دستکش، روپوش، شیلد).
- استفاده از هود بیولوژیکی در مراحل استخراج DNA/RNA.
- ضدعفونی منظم سطوح با هیپوکلریت یا الکل 70%.
- جداسازی فیزیکی مناطق قبل از PCR و بعد از PCR برای جلوگیری از آلودگی متقاطع.
صفحه 8 از 8
5. پیوستها
- فرم پذیرش نمونههای مولکولی / FISH / NGS
- فرم QC کنترل کیفیت DNA/RNA
- فرم گزارش رد نمونه
- فرم ثبت دمای حمل نمونهها
6. رفرنسها
- ISO 15189:2022 – Medical Laboratories – Requirements for Quality and Competence
- CLSI MM01-A3 – Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases
- CLSI MM13-A – Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods
- ACMG Technical Standards for NGS, 2023
- دستورالعملهای وزارت بهداشت ایران، اداره ژنتیک و آزمایشگاه مرجع سلامت، 1403
📘 تهیه و گردآوری:
توسط گروه ژنهای طلایی
آزمایشگاه تخصصی ژنتیک مولکولی و سیتوژنتیک