مراحل تکنیک هیبریداسیون فلورسانس در محل (FISH) معمولا شامل موارد زیر است:

آماده سازی نمونه

یک نمونه بیولوژیکی مانند بافت یا سلول به دست آورید و با تثبیت و نفوذپذیری سلول ها آن را برای FISH آماده کنید. نمونه (به عنوان مثال، بخش بافت یا سلول ها) روی یک اسلاید میکروسکوپ ثابت می شود و برای حفظ DNA/RNA هدف و قابل مشاهده کردن کروموزوم ها در زیر میکروسکوپ درمان می شود. اسلایدها را می توان حداقل به مدت یک سال در فریزر در دمای 80 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

آماده سازی پروب ها

کاوشگرها توالی های DNA یا RNA تک رشته ای هستند که مکمل توالی های هدف هستند. پروب ها با رنگ فلورسنت برچسب گذاری می شوند تا در زیر میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده باشند.

برچسب زدن پروب

کاوشگرهای FISH را با یک رنگ فلورسنت برچسب بزنید که به مناطق خاصی از DNA هدف متصل می شود. پروب ها می توانند به طور مستقیم با فلوروفور برچسب گذاری شوند یا به طور غیرمستقیم با یک هاپتن برچسب گذاری شوند که بعدا می تواند از طریق یک تکنیک تشخیص آنزیمی یا ایمونولوژیک شناسایی شود.

در حال حاضر چندین تکنیک برای برچسب گذاری پروب های DNA برای هیبریداسیون غیر رادیواکتیو در محل وجود دارد. محبوب ترین استراتژی برچسب زدن کاوشگر با مواد شیمیایی گزارشگر (haptens) است. چندین hapten مختلف در بازار وجود دارد, از جمله بیوتین, digoxigenin, dinitrophenol, fluorescein, رودامین, AMCA, و کومارین. طبق پروتکل های استاندارد، این هاپتن ها را می توان به عنوان نوکلئوتیدهای برچسب دار با استفاده از تکنیک های ترجمه نیک، برچسب گذاری پرایمر تصادفی یا تکنیک های برچسب گذاری PCR گنجاند.

مراحل تکنیک FISH

دناتوره شدن: فرآیند شکستن پیوندهای هیدروژنی در یک مولکول DNA دو رشته ای برای ایجاد یک مولکول DNA تک رشته ای به عنوان دناتوره شدن شناخته می شود. به طور معمول، این کار با گرم کردن نمونه DNA تا دمای بالا (بین 80 تا 100 درجه سانتیگراد) انجام می شود که رشته های DNA را از هم جدا می کند. سپس کاوشگر مکمل را می توان با مولکول های DNA تک رشته ای هیبرید کرد تا امکان تصویربرداری و مکان یابی توالی های DNA خاص در سلول ها یا بافت ها را فراهم کند.

هیبریداسیون: نمونه را با پروب های برچسب گذاری شده جوجه کشی کنید ، به آنها اجازه می دهد تا به DNA هدف هیبرید (متصل شوند). در طی هیبریداسیون ، پروب های برچسب دار به نمونه اضافه می شوند و اجازه می دهند به توالی های DNA مکمل در هدف متصل شوند. این فرآیند اتصال خاص است، به این معنی که پروب ها فقط به هدف مورد نظر خود متصل می شوند و به محقق اجازه می دهند مناطق خاصی از DNA را تجسم کند. شرایط هیبریداسیون مانند دما، غلظت نمک و زمان انکوباسیون به دقت کنترل می شود تا از اتصال بهینه پروب ها به DNA هدف اطمینان حاصل شود

شستشو: نمونه را بشویید تا پروب های نامحدود، سیگنال پس زمینه را کاهش دهید و ویژگی را افزایش دهید. غلظت بالای نمک در محلول شستشو اغلب به حذف پروب های غیر-محدود و کاهش اتصال غیر اختصاصی کمک می کند. شستشوی چندگانه نمونه امکان کاهش شدید سیگنال پس زمینه را دارد.

تشخیص: پروب های محدود شده را با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس تجسم کنید و تصاویر بگیرید. تجسم در این تکنیک معمولا شامل استفاده از میکروسکوپ فلورسانس برای شناسایی و تجسم پروب های محدود است. نمونه در زیر یک میکروسکوپ فلورسانس مجهز به فیلتری مشاهده می شود که مخصوص طول موج نور ساطع شده از رنگ فلورسنت مورد استفاده برای برچسب گذاری پروب ها است. در تکنیک FISH، هر کاوشگر با یک رنگ فلورسانس متفاوت برچسب گذاری می شود که اجازه می دهد چندین پروب به طور همزمان تجسم شوند. سیگنال های فلورسانس را می توان در زمان واقعی مشاهده کرد یا به عنوان تصاویر برای تجزیه و تحلیل بعدی ثبت کرد.

علاوه بر این، اگر کاوشگر به طور غیرمستقیم با آن برچسب گذاری شده باشد، ابتدا باید هاپتن غیر فلورسنت را با استفاده از تکنیک تشخیص آنزیمی یا ایمونولوژیک مشاهده کرد.

تحلیل: تصاویر گرفته شده را برای تعیین توزیع و تعداد سیگنال های فلورسنت تجزیه و تحلیل کنید که می تواند اطلاعاتی در مورد تغییرات ژنتیکی در نمونه ارائه دهد.

تفسیر: نتایج با در نظر گرفتن الگوی سیگنال های فلورسانس برای تعیین حضور، عدم وجود یا بازآرایی توالی های هدف تفسیر و تجزیه و تحلیل می شوند. نتایج را تفسیر کنید، که می تواند بینشی در مورد تغییرات ژنتیکی، انحرافات کروموزومی، الگوهای بیان ژن و سایر فرآیندهای بیولوژیکی ارائه دهد.

گزارش: نتایج را گزارش دهید، که می تواند برای هدایت تحقیقات بیشتر و تصمیم گیری بالینی اطلاع رسانی شود.

برنامه:

تشخیص ناهنجاری های کروموزومی قبل از تولد: این یک تکنیک پرکاربرد در سیتوژنتیک برای تجسم توالی های DNA خاص در کروموزوم ها و تشخیص ناهنجاری های کروموزومی است. FISH می تواند ناهنجاری های کروموزومی خاصی مانند حذف، تکثیر و جابجایی را که اغلب با اختلالات ژنتیکی و سرطان همراه است، تشخیص دهد. علاوه بر این، این تکنیک در تشخیص قبل از تولد برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی در جنین در حال رشد استفاده می شود و اطلاعات مهمی را برای مشاوره ژنتیک و برنامه ریزی درمان فراهم می کند.

تشخیص انواع شماره کپی (CNV): انواع تعداد کپی (CNVs) به تغییرات در تعداد کپی های یک توالی DNA خاص در یک ژنوم اشاره دارد. این تغییرات می تواند منجر به سود یا از دست دادن مواد ژنتیکی شود که می تواند به اختلالات ژنتیکی و بیماری هایی مانند سرطان کمک کند. هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) یک تکنیک پرکاربرد برای تشخیص CNVs است.

تشخیص سرطان: FISH برای تشخیص انواع مختلف سرطان از جمله سرطان خون، لنفوم و تومورهای جامد استفاده می شود. این تکنیک می تواند ناهنجاری های کروموزومی خاص و بازآرایی ژن هایی را که مشخصه برخی سرطان ها هستند، تشخیص دهد. می توان از آن برای نظارت بر پاسخ سرطان به درمان با تشخیص تغییرات در بیان ژن و ساختار کروموزومی استفاده کرد. این اطلاعات می تواند به تعیین اثربخشی درمان و اینکه آیا تغییر در درمان ضروری است یا خیر، کمک کند.

تشخیص بیماری های عفونی: FISH برای شناسایی پاتوژن های عفونی با تجزیه و تحلیل RNA ریبوزومی 16S (rRNA) متمایز از گروه های فیلوژنتیکی استفاده می شود. برای بررسی جوامع میکروبی در حفره دهان و فلور دستگاه گوارش می توان از کاوشگرهای FISH ساخته شده از توالی های الیگونوکلئوتیدی (به طول 17 تا 34 نوکلئوتید) مکمل 16S rRNA استفاده کرد. جمعیت میکروبی در روده و حفره دهان بسیار زیاد است و از FISH برای شناسایی پاتوژن ها استفاده شده است. باکتری های ایجاد کننده عفونت های دستگاه تنفسی نیز در طراحی پروب های الیگونوکلئوتیدی خاص هدف قرار گرفته اند. همچنین از FISH برای شناسایی عفونت ها در بافت ها به روشی مشابه استفاده شده است. باکتری های بیماری زا در کشت خون با استفاده از پروب های الیگونوکلئوتیدی اختصاصی جنس و گونه شناسایی شده اند. به عنوان مثال، پروب های FISH که مکمل یک توالی rRNA 16s هستند می توانند عفونت مالاریا را در نمونه های خون شناسایی کنند.

ژنتیک: FISH برای شناسایی و مکان یابی جهش های ژنتیکی خاص در یک نمونه استفاده می شود و اطلاعات مهمی را برای مشاوره ژنتیکی و تشخیص اختلالات ژنتیکی فراهم می کند.

کشف دارو: ماهی در تحقیقات کشف دارو برای ارزیابی اثربخشی داروهای جدید با ردیابی تغییرات بیان ژن و ساختار کروموزومی در پاسخ به درمان دارویی استفاده می شود.

علوم اعصاب: FISH در تحقیقات علوم اعصاب برای مطالعه محلی سازی و بیان ژن های خاص در مغز استفاده می شود و بینش مهمی در مورد زیست شناسی سیستم عصبی ارائه می دهد.

محدودیت:

هنگام استفاده از چندین کاوشگر در یک آزمایش، انجام و تجزیه و تحلیل FISH می تواند پیچیده باشد و به ابزارها و دانش خاصی نیاز دارد. همانند کاوشگرهای FISH، اهداف غیراختصاصی ممکن است به آنها متصل شوند و نتایج مثبت کاذب ایجاد کنند و تفسیر را دشوارتر کنند. با وضوح معمول حدود 10-50 کیلوبایت، این رویکرد وضوح نسبتا پایینی دارد. این بدان معناست که ممکن است نتواند CNV های کوچک یا تغییرات در عناصر ساختاری ژنوم را تشخیص دهد.

در حالی که FISH یک روش موثر برای شناسایی توالی های DNA خاص و انحرافات کروموزومی است, برخی از اشکالاتی وجود دارد که باید هنگام تعیین اینکه آیا FISH مناسب ترین روش برای یک مطالعه خاص است یا خیر, در نظر گرفته شود.