ریل تایم PCR (Real-Time PCR) چیست؟

ریل تایم PCR (Real-Time PCR) چیست؟

ریل تایم PCR یا PCR کمی (qPCR)، یک روش مولکولی پیشرفته برای تشخیص و اندازه‌گیری دقیق مقدار DNA یا RNA هدف در نمونه‌های بیولوژیکی است. برخلاف PCR معمولی که فقط حضور ژن را تایید می‌کند، در qPCR می‌توان به‌صورت لحظه‌ای (real-time) میزان تکثیر ماده ژنتیکی را مشاهده و اندازه‌گیری کرد.

🧪 نحوه عملکرد ریل تایم PCR

فرآیند qPCR به‌صورت کلی شامل مراحل زیر است:

1. استخراج ماده ژنتیکی (DNA یا RNA).
2. طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژن هدف.
3. واکنش PCR با استفاده از آنزیم Taq polymerase.
4. ردیابی لحظه‌ای تکثیر DNA به‌وسیله فلورسانس:
   • استفاده از رنگ‌های بین‌مولکولی مانند SYBR Green که به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شود.
   • یا استفاده از پروب‌های اختصاصی فلورسانس (مانند TaqMan) که به نواحی خاصی از DNA متصل می‌شوند.
5. تجزیه و تحلیل منحنی تکثیر برای محاسبه مقدار اولیه DNA یا RNA.

🔬 انواع ریل تایم PCR

1. SYBR Green qPCR:
   • ساده، ارزان و عمومی.
   • فلورسانس با اتصال به DNA دو رشته‌ای.
   • ممکن است با محصولات غیر اختصاصی هم سیگنال دهد.
2. TaqMan qPCR:
   • استفاده از پروب اختصاصی با برچسب فلورسانس و Quencher.
   • اختصاصی‌تر و دقیق‌تر نسبت به SYBR Green.
   • هزینه بیشتر به‌دلیل طراحی پروب.
3. Molecular Beacon و Scorpion Probes:
   • ساختارهای حلقه‌ای با سیگنال‌دهی بسیار دقیق.
   • در تحقیقات پیشرفته و تخصصی استفاده می‌شوند.

✅ مزایای Real-Time PCR

• حساسیت بسیار بالا (تشخیص مقادیر بسیار کم).
• اختصاصیت بالا (تشخیص توالی خاص ژنتیکی).
• سنجش کمی (برخلاف PCR معمولی).
• سرعت بالا (نتایج ظرف چند ساعت).
• مناسب برای تست‌های تشخیصی بالینی.

❌ معایب Real-Time PCR

• هزینه بالا (مواد، دستگاه و طراحی پروب).
• نیاز به تجهیزات تخصصی (ترموسایکلر فلورسانس‌خوان).
• امکان آلودگی و نتایج مثبت کاذب در صورت عدم رعایت اصول آزمایشگاهی.
• نیاز به اپراتور ماهر و تحلیل دقیق داده‌ها.

🧫 کاربردها و تست‌هایی که با qPCR انجام می‌شود

• تشخیص عفونت‌های ویروسی و باکتریایی:
  • مانند COVID-19، HPV، HBV، HCV، HIV و آنفلوآنزا.
• بررسی بیان ژن (Gene Expression):
  • با استفاده از RT-qPCR برای RNA.
• شناسایی جهش‌های ژنتیکی و پلی‌مورفیسم‌ها.
• شناسایی سرطان‌ها و بیومارکرهای توموری.
• غربالگری محصولات تراریخته (GMO).
• کنترل کیفیت مواد غذایی و دارویی.

📚 منابع علمی معتبر (رفرنس‌ها)

1. Kubista, M. et al. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27(2-3), 95–125. https://doi.org/10.1016/j.mam.2005.12.007
2. Bustin, S.A. et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797
3. Mackay, I.M. et al. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30(6), 1292–1305. https://doi.org/10.1093/nar/30.6.1292