PROBE X-Y

بروشور فنی کیت آماده سازی بافت FISH

۱. هدف از کاربرد (Intended Use)

کیت FISH® Tissue Pretreatment Kit به همراه پروب‌های FISH®، جهت آماده‌سازی نمونه‌های بافتی فیکس‌شده با فرمالین و تعبیه‌شده در پارافین (FFPE) برای انجام فرآیندهای هیبریداسیون فلورسنت درجا (FISH) طراحی شده است. این کیت مراحل آماده‌سازی اولیه بافت پاتولوژی را تسهیل و استاندارد می‌سازد.

۲.  آزمایش (Test Principle)

تکنیک هیبریداسیون فلورسنت درجا (FISH)، بر پایه اتصال اختصاصی (Hybridization) پروب‌های DNA نشان‌دار با توالی‌های مکمل از DNA ژنوم سلول هدف استوار است.

مراحل اصلی :

1. دناتوراسیون (Denaturation): تک‌رشته‌ای کردن DNA هدف روی لام.
2. هیبریداسیون (Hybridization): اتصال پروب نشان‌دار به ناحیه ژنتیکی مکمل.
3. شستشوی پس از هیبریداسیون (Post-Hybridization Wash): حذف پروب‌های متصل‌نشده یا غیراختصاصی.
4. رنگ‌آمیزی متضاد (Counterstaining): استفاده از DAPI برای مشخص کردن ساختار کروماتین و مورفولوژی هسته سلول.
5. تصویربرداری (Imaging): مشاهده سیگنال‌ها با میکروسکوپ فلورسنت مجهز به فیلترهای نوری مناسب (قرمز، سبز، آبی).

این فرآیند امکان بررسی کیفی تغییرات ساختاری ژنتیکی (حذف، تکثیر، شکست-جدایی یا ادغام) را در هسته‌های بین‌فازی (Interphase) و کروموزوم‌های متافازی فراهم می‌کند.

۳. محتویات کیت و شرایط نگهداری (Kit Components & Storage)

معرف (Reagent)مشخصات شیمیاییحجم / تعداد تستشرایط نگهداریRetrieval Solutionمحلول اسید سیتریک (pH 6.0)۵۰۰ میلی‌لیتر (۵۰ تست)دمای ۴ تا ۸ درجه سانتی‌گرادEnzyme Reagentمحلول پپسین در ۰.۲ نرمال اسید کلریدریک (HCl)۵ میلی‌لیتر (۵۰ تست)دمای ۴ تا ۸ درجه سانتی‌گراد

• پایداری: در صورت رعایت شرایط دمایی (۴ تا ۸ درجه سانتی‌گراد)، معرف‌ها تا تاریخ انقضای درج‌شده روی برچسب پایدار هستند. بلافاصله پس از استفاده، معرف‌ها را به یخچال بازگردانید.

۴. مواد و تجهیزات مورد نیاز (تأمین‌نشده توسط کیت)

• حمام آب (Water Bath) با قابلیت تنظیم تا ۹۸ درجه سانتی‌گراد
• دستگاه هیبریداسیون یا صفحه داغ (Hot Plate) با قابلیت گرمایش تا ۸۰ درجه سانتی‌گراد
• انکوباتور (Etüv) با قابلیت تنظیم تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد
• ظروف شستشوی مخصوص لام پاتولوژی (Coplin Jar)
• میکروسکوپ فلورسنت مجهز به فیلترهای مناسب و روغن ایمرسیون تایید شده
• لامل پلاستیکی/شیشه‌ای (در ابعاد ۲۲×۲۲ و ۲۴×۲۴ میلی‌متر) و لام با بار مثبت
• چسب لاستیکی آب‌بندی (مانند Fixogum)
• دماسنج کالیبره شده و تایمر
• الکل اتانول (۱۰۰٪، ۸۵٪، ۷۰٪)، زایلن (Xylene)، محلول 20X SSC، توئین-۲۰ (Tween-20) و آب دی‌یونیزه یا مقطر ($dH_2O$)

۵. هشدارها و اقدامات احتیاطی (Warnings & Precautions)

• صرفاً برای مصارف تشخیص آزمایشگاهی (IVD - In Vitro Diagnostic) و استفاده کاربران حرفه‌ای.
• به دلیل پتانسیل سرطان‌زایی محلول رنگ‌آمیزی متضاد (DAPI)، هنگام کار با آن حتماً از دستکش، عینک محافظ و روپوش استفاده نمایید.
• پروب‌های DNA به نور مستقیم حساس هستند؛ کلیه مراحل را در محیط تاریک یا ظروف ضد نور انجام دهید.
• برای جلوگیری از آلودگی متقاطع (Cross-contamination) برای هر نمونه از تجهیزات مجزا استفاده کنید.
• عدم پایبندی به زمان‌ها و دماهای ذکر شده، منجر به نتایج مثبت یا منفی کاذب خواهد شد. از رقیق‌سازی یا مخلوط کردن پروب‌ها با سایر محصولات خودداری کنید.

۶. دستورالعمل پروتکل اجرایی (Step-by-Step Protocol)

روز اول

گام اول: آماده‌سازی پرپارات‌های FFPE

1. تثبیت (Fixation): نمونه بافتی را به مدت حداکثر ۲۴ ساعت در فرمالین ۱۰٪ بافر خنثی در دمای اتاق ($18-25^\circ C$) فیکس کنید. سپس بلوک پارافینی تهیه نمایید.
2. برش‌گیری (Sectioning): برش‌هایی به ضخامت ۳ تا ۵ میکرون تهیه کرده و روی لام‌های با بار مثبت قرار داده و کاملاً خشک کنید.

گام دوم: پارافین‌زدایی (Deparaffinization) و رِهیدراسیون

1. گرمادهی: لام‌ها را به مدت ۲ ساعت در دمای $80^\circ C$ انکوبه کنید.
2. زایلن: لام‌ها را ۲ بار، هر بار به مدت ۱۰ دقیقه در زایلن (دمای اتاق) قرار دهید.
3. دهیدراسیون با الکل: لام‌ها را به ترتیب در اتانول ۱۰۰٪، ۸۵٪ و ۷۰٪ هر کدام به مدت ۲ دقیقه انکوبه کنید.
4. شستشو با آب: لام‌ها را ۲ بار، هر بار به مدت ۲ دقیقه در آب دی‌یونیزه ($dH_2O$) دمای اتاق بشویید.

گام سوم: پیش‌درمان حرارتی (Pretreatment)

1. ظرف حاوی محلول بازیابی (Retrieval Solution) را در حمام آب قرار داده و دمای آن را به ۹۸ تا ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد برسانید.
2. لام‌ها را به مدت ۳۰ دقیقه در محلول جوشان قرار دهید.
3. لام‌ها را ۲ بار، هر بار ۳ دقیقه در آب دی‌یونیزه در دمای اتاق بشویید.

گام چهارم: هضم آنزیمی (Enzymatic Digestion)

1. معرف آنزیمی را به سطح بافت اضافه کرده و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای $37^\circ C$ قرار دهید.
2. لام‌ها را ۳ بار، هر بار ۲ دقیقه در آب دی‌یونیزه بشویید.
3. لام‌ها را به ترتیب در سری اتانول (۷۰٪، ۸۵٪، ۱۰۰٪ و مجدداً ۱۰۰٪) هر کدام ۲ دقیقه قرار داده و سپس در هوا خشک کنید.

گام پنجم: دناتوراسیون و هیبریداسیون (Denaturation & Hybridization)

1. ۱۰ میکرولیتر از پروب iFISH® را روی نمونه اعمال کنید.
2. لامل ۲۲×۲۲ را قرار داده و دور آن را با چسب عایق کنید.
3. لام‌ها را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای $80^\circ C$ دناتوره کنید.
4. لام‌ها را در محفظه مرطوب تاریک قرار داده و به مدت ۱۶ تا ۱۸ ساعت در دمای $37^\circ C$ هیبرید کنید.

روز دوم

گام ششم: شستشو و رنگ‌آمیزی پس از هیبریداسیون

1. چسب و لامل را جدا کنید.
2. لام‌ها را به مدت ۴۵ ثانیه در محلول 0.4X SSC در دمای ۷۵ درجه سانتی‌گراد قرار دهید.
3. لام‌ها را به مدت ۱ دقیقه در محلول 2X SSC حاوی ۰.۰۵٪ Tween-20 در دمای اتاق قرار دهید.
4. پس از خشک کردن لام‌ها، ۱۰ میکرولیتر رنگ متضاد DAPI iFISH® اعمال کرده و لامل بگذارید.

۷. جدول زمان‌بندی پیشنهادی بر اساس نوع بافت (Tissue Optimization Table)

نوع بافتزمان جوشاندن (دقیقه)زمان هضم آنزیمی (دقیقه)پستان (Breast)۴۵۳۰ریه (Lung)۲۵۱۵ - ۲۰تخمدان (Ovary)۲۵۱۵کلیه (Kidney)۲۵۲۵ - ۳۰روده بزرگ (Colon)۴۰۲۰

۸. عیب‌یابی (Troubleshooting)

مشکلعلت احتمالیراه‌حلضعف سیگنالدمای/زمان نادرست دناتوراسیونصحت دمای ۸۰ درجه و ۱۰ دقیقه را چک کنید.پس‌زمینه بالاهضم بیش از حد آنزیمیزمان هضم آنزیمی را کاهش دهید.خشک شدن بافتعایق‌بندی ضعیف لاملاز چسب Fixogum استفاده کرده و محفظه را مرطوب نگه دارید.

۹. نمادهای استاندارد (EN ISO 15223-1:2021)

⚠️ احتیاط | 🧪 IVD | 🏭 تولیدکننده ⏳ تاریخ انقضا | 🌡️ دمای نگهداری | 🔍 REF | 🔢 LOT | |

بروشور انگلیسی

Page 1 of 3

Instructions for Use (IFU)

In Vitro Diagnostic Medical Device

According to EU Directive 98/79/EC

Intended Use

The ELZ-1006 iFISH® Cen X/Y α-satellite Probe is a three-color probe combination designed to detect numerical abnormalities of human X and Y chromosomes using the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.

It is used in cytogenetic evaluations related to prenatal diagnosis and congenital anomalies.

Clinical Relevance

Disorders such as Turner syndrome (45,X), Klinefelter syndrome (47,XXY), 47,XYY, and 47,XXX are among the most frequently investigated sex chromosome aneuploidies in prenatal diagnosis.

This kit contains dual-color probes targeting the following α-satellite sequences:

• DXZ1 specific to chromosome X (Xp11.1–q11.1)
• DYZ3 specific to chromosome Y (Yp11.1–q11.1)

This enables rapid and direct detection of numerical chromosomal abnormalities in aneuploidy screening.

Advantages over Conventional Cytogenetic Methods

FISH-based analyses provide results in a shorter time compared to conventional cytogenetic techniques and are particularly advantageous for evaluating chromosomal structures in interphase nuclei derived from fetal cells.

Therefore, this kit is considered a valuable molecular cytogenetic tool for confirming trisomies and sex chromosome abnormalities in samples obtained during invasive prenatal diagnostic procedures (amniocentesis, CVS).

Supplied Reagents

Probe Specifications:

• DXZ1, Xp11.1–q11.1 – Green
• DYZ3, Yp11.1–q11.1 – Orange

The green-labeled probe targets the centromeric DXZ1 sequence of chromosome X.

The orange-labeled probe targets the centromeric DYZ3 sequence of chromosome Y.

Required Additional Materials

• Water bath adjustable to 70°C
• Hybridization device or hot plate up to 80°C
• Humidified hybridization chamber
• Microscope slides
• 24×24 mm coverslips
• Incubator adjustable to 37°C
• Properly equipped fluorescence microscope
• Approved immersion oil
• Calibrated thermometer
• Timer
• Rubber sealing solution (e.g., Fixogum Rubber Cement)
• Slide washing containers
• Deionized or distilled water
• Tween‑20
• 100% ethanol
• 20X SSC (sodium saline citrate) solution

Warnings and Precautions

• For in vitro diagnostic use only and intended for professional users.
• Read instructions before use.
• Wear disposable gloves, protective goggles, and lab coat when handling DNA probes or DAPI.
• DAPI should be handled with care due to potential carcinogenic effects.
• Avoid direct contact with reagents.
• Probes are light sensitive; procedures should be performed in darkness.
• Avoid cross-contamination of samples.
• Do not dilute or mix probes with other products.
• Operators must be able to distinguish green, orange, and blue colors.
• Dispose of all waste according to institutional regulations.

Test Principle

iFISH® products are based on in situ hybridization of DNA probes designed for specific genetic regions with sample cell DNA.

Cells on prepared slides are fixed and denatured, followed by application of labeled probes.

Unbound probes are removed by washing, and DAPI counterstaining is applied.

Hybridized probe fragments are visualized using a fluorescence microscope equipped with appropriate excitation and emission filters.

This method allows qualitative evaluation in both metaphase chromosomes and interphase nuclei.

بروشور فارسی

شماره بازنگری: 1.0 ژن های طلایی

صفحه 1 از 3

دستورالعمل استفاده 

وسیله تشخیصی پزشکی مورد استفاده در خارج از بدن (In Vitro Diagnostic)

مطابق با دستورالعمل 98/79/EC اتحادیه اروپا

کاربرد مورد نظر بخشهای ژنتیک و ناباروری بیوتکنولوژی

پروب ELZ-1006 iFISH® Cen X/Y α-satellite یک ترکیب پروب سه‌رنگ است که برای شناسایی ناهنجاری‌های عددی کروموزوم‌های X و Y انسان با استفاده از تکنیک فلورسانس درجا (FISH) طراحی شده است.

این محصول در ارزیابی‌های سیتوژنتیکی مرتبط با تشخیص پیش از تولد و ناهنجاری‌های مادرزادی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ارتباط بالینی

اختلالاتی مانند سندرم ترنر (45,X)، سندرم کلاین‌فلتر (47,XXY)، 47,XYY و 47,XXX از جمله ناهنجاری‌های شایع کروموزوم‌های جنسی هستند که در تشخیص‌های پیش از تولد به‌طور مکرر بررسی می‌شوند.

این کیت شامل پروب‌های دو رنگ است که توالی‌های α-ساتلایت زیر را هدف قرار می‌دهند:

• DXZ1 اختصاصی کروموزوم X (Xp11.1–q11.1)
• DYZ3 اختصاصی کروموزوم Y (Yp11.1–q11.1)

این ویژگی امکان شناسایی مستقیم و سریع ناهنجاری‌های عددی کروموزومی را در غربالگری آنئوپلوئیدی فراهم می‌سازد.

مزایا نسبت به روش‌های سیتوژنتیک سنتی

آنالیزهای مبتنی بر FISH نسبت به روش‌های کلاسیک، نتایج را در زمان کوتاه‌تری ارائه می‌دهند و به‌ویژه برای ارزیابی ساختار کروموزومی در هسته سلول‌های جنینی بسیار مناسب هستند.

به همین دلیل، این کیت به‌عنوان یک ابزار ارزشمند سیتوژنتیک مولکولی برای تأیید تریزومی‌ها و ناهنجاری‌های کروموزوم‌های جنسی در نمونه‌های حاصل از روش‌های تهاجمی تشخیص پیش از تولد (مانند آمنیوسنتز و CVS) شناخته می‌شود.

مواد تأمین‌شده

مشخصات پروب:

• DXZ1، Xp11.1–q11.1 – سبز
• DYZ3، Yp11.1–q11.1 – نارنجی

پروب نشاندار شده با فلوروفور سبز، ناحیه سانترومری DXZ1 در کروموزوم X را هدف قرار می‌دهد.

پروب نشاندار شده با فلوروفور نارنجی، ناحیه سانترومری DYZ3 در کروموزوم Y را هدف قرار می‌دهد.

سایر مواد مورد نیاز

• حمام آب قابل تنظیم تا 70°C
• دستگاه هیبریداسیون یا صفحه گرم‌کن تا 80°C
• محفظه مرطوب برای هیبریداسیون
• لام میکروسکوپ
• لامل 24×24 میلی‌متر
• انکوباتور قابل تنظیم در 37°C
• میکروسکوپ فلورسنت مجهز
• روغن ایمرسیون تأییدشده
• دماسنج کالیبره‌شده
• تایمر
• محلول عایق لاستیکی (مانند Fixogum Rubber Cement)
• ظروف شستشوی لام
• آب دی‌یونیزه یا مقطر
• Tween‑20
• اتانول 100٪
• محلول 20X SSC (سدیم سالین سیترات)

هشدارها و اقدامات احتیاطی

• این محصول فقط برای تشخیص in vitro و استفاده حرفه‌ای طراحی شده است.
• پیش از استفاده، دستورالعمل را به‌دقت مطالعه کنید.
• هنگام کار با پروب‌های DNA و DAPI از دستکش، عینک و روپوش آزمایشگاهی استفاده شود.
• DAPI به دلیل احتمال سرطان‌زایی باید با احتیاط استفاده گردد.
• از تماس مستقیم مواد با پوست خودداری شود.
• پروب به نور حساس است؛ تمام مراحل در محیط تاریک انجام شود.
• از آلودگی متقاطع نمونه‌ها جلوگیری شود.
• از رقیق‌سازی یا مخلوط کردن پروب با محصولات دیگر خودداری گردد.
• اپراتور باید قادر به تشخیص رنگ‌های سبز، نارنجی و آبی باشد.
• تمام ضایعات مطابق مقررات ایمنی دفع شوند.

اصل آزمون

محصولات iFISH® بر پایه هیبریداسیون درجا بین پروب‌های DNA اختصاصی و DNA سلول نمونه طراحی شده‌اند.

پس از فیکس و دناتوره‌کردن سلول‌ها، پروب نشاندار شده اضافه می‌شود.

پروب‌های متصل‌نشده شسته شده و سپس رنگ‌آمیزی متقابل با DAPI انجام می‌شود.

سیگنال‌ها با میکروسکوپ فلورسنت مناسب مشاهده و تحلیل می‌گردند.

این روش امکان ارزیابی کیفی در متافاز و اینترفاز را فراهم می‌کند.