دستنامه جامع پروتکل‌های سیتوژنتیک و ژنتیک مولکولی بالینی

تدوین و نویسنده: بهنیا صادقی  

بنیان‌گذار و مدیرعامل تیم تخصصی ژن‌های طلایی
نسخه اینترنتی (e-Book) | ویراست اول ۱۴۰۵

بخش اول: سیتوژنتیک بالینی خون محیطی (Peripheral Blood Cytogenetics)

• 
  
  • پروتکل ۱.۱: پروتکل کشت و کاریوتایپ روتین لنفوسیت‌های خون محیطی (Standard 72-Hour Blood Culture Protocol)
  • پروتکل ۱.۲: پروتکل کاریوتایپ رزولوشن بالا با مهار چرخه‌ی سلولی (High-Resolution Banding - MTX/Thymidine Synchronization Protocol)
  • پروتکل ۱.۳: پروتکل کاریوتایپ سریع خون (Fast 48-Hour HR Blood Karyotyping)
  • پروتکل ۱.۴: تکنیک‌های هضم آنزیمی و باندینگ کروموزومی:
    • پروتکل استاندارد باندینگ تریپسین-گیمسا (GTG Banding Protocol)
    • پروتکل باندینگ معکوس (RHG Banding Protocol)
    • پروتکل باندینگ نواحی هتروکروماتین مرکزی (CBG Banding Protocol)
    • پروتکل رنگ‌آمیزی نواحی سازمان‌دهنده هستک (Ag-NOR Silver Staining Protocol)
• بخش دوم: سیتوژنتیک پیش از تولد (Prenatal Cytogenetics)
• 
  
  • پروتکل ۲.۱: پروتکل کشت مایع آمنیوتیک به روش سوسپانسیونی (Suspension Culture Protocol for Amniotic Fluid)
  • پروتکل ۲.۲: پروتکل کشت مایع آمنیوتیک به روش کلونی/لامی (In Situ / Coverslip Culture Protocol for Amniocentesis)
  • پروتکل ۲.۳: پروتکل هاروست، فیکساسیون و باندینگ سلول‌های آمنیوسیت (Harvesting & GTG Banding of Amniocytes)
  • پروتکل ۲.۴: پروتکل کشت و پردازش نمونه‌های پرزهای کوریونی جفت (CVS Direct Prep & Long-Term Culture Protocol)
  • پروتکل ۲.۵: پروتکل شناسایی و تفکیک موزائیسم‌های سیتوژنتیکی کاذب از واقعی (Pseudomosaicism vs. True Mosaicism Protocol)
• بخش سوم: انکو-سیتوژنتیک تشخیصی و مغز استخوان (Onco-Hematology Cytogenetics)
• 
  
  • پروتکل ۳.۱: پروتکل مستقیم و کوتاه‌مدت کشت آسپیره مغز استخوان (Direct & 24h/48h Bone Marrow Culture Protocol)
  • پروتکل ۳.۲: پروتکل کشت خون محیطی برای لوسمی‌ها و اختلالات لنفوپرولیفراتیو (PHA-Negative Cultures & Mitogen-Stimulated CLL with CpG Oligonucleotide/DSP30)
  • پروتکل ۳.۳: پروتکل هاروست اختصاصی مغز استخوان و تیمار هیپوتونیک حساس (Bone Marrow Harvest & Hypotonic Shock)
  • پروتکل ۳.۴: راهنمای آنالیز کروموزومی و گزارش‌نویسی کلونال نئوپلازی‌ها بر اساس استاندارد ISCN
• بخش چهارم: تکنیک FISH در بافت‌های توموری جامد (Solid Tumor FISH - HER2 Focus)
• 
  
  • پروتکل ۴.۱: پروتکل پیش‌تیمار و آماده‌سازی بافت فیکس‌شده با فرمالین و قالب‌گیری در پارافین (FFPE Tissue Pretreatment & Deparaffinization Protocol)
  • پروتکل ۴.۲: پروتکل بازیابی آنتی‌ژن با حرارت (HIER - Heat-Induced Epitope Retrieval with Citrate Buffer pH 6.0)
  • پروتکل ۴.۳: پروتکل هضم آنزیمی کنترل‌شده با پپسین (Pepsin Proteolytic Digestion Protocol)
  • پروتکل ۴.۴: پروتکل دناتوراسیون، کو-هیبریداسیون و شستشوی پس از هیبریداسیون (Post-Hybridization Stringency Washes)
  • پروتکل ۴.۵: پروتکل تخصصی ارزیابی پروب دو رنگ HER2/CEP17 (Dual-Color HER2 (ERBB2)/CEN17 FISH Assay)
  • پروتکل ۴.۶: پروتکل تشخیصی ضایعات نسج سخت و بیوپسی‌های سرطان ریه (ALK, ROS1, RET Break-Apart FISH)
• بخش پنجم: تکنیک FISH در انکو-هماتولوژی (Hematologic Malignancies FISH)
• 
  
  • پروتکل ۵.۱: پروتکل فیش بر روی لام‌های مغز استخوان و خون محیطی لام‌اندازی‌شده (Fixed-Cell Suspension FISH)
  • پروتکل ۵.۲: پنل فیش تشخیصی لوسمی میلوئیدی مزمن (CML: BCR::ABL1 Dual-Fusion / Tri-Color)
  • پروتکل ۵.۳: پنل سیتوژنومیک لوسمی حاد میلوئیدی (AML: RUNX1::RUNX1T1, PML::RARA, CBFB, KMT2A/MLL)
  • پروتکل ۵.۴: پنل تشخیصی لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL Panel: del(13q), del(11q/ATM), del(17p/TP53), Trisomy 12)
  • پروتکل ۵.۵: پنل پیش‌آگهی مالتیپل میلوما پس از جداسازی سلول‌های پلاسما با مگنت CD138 (Multiple Myeloma FISH: IGH rearrangements, 1q gain, del(17p))
• بخش ششم: سیتوژنتیک مولکولی باروری و جنین (Reproductive & PGD/PGT Cytogenetics)
• 
  
  • پروتکل ۶.۱: پروتکل فیش تعیین جنسیت سریع و شمارش آنیوپلوئیدی‌ها در گامت و بلستومر (Aneuploidy Screening: X, Y, 13, 18, 21 FISH)
  • پروتکل ۶.۲: پروتکل ارزیابی آنیوپلوئیدی اسپرم به روش فیش چندرنگ (Sperm Multi-Color FISH Aneuploidy Test)
  • پروتکل ۶.۳: پروتکل متوالی ترکیب سیتوژنتیک مرسوم و فیش روی یک لام (Sequential Karyotyping to FISH Re-Hybridization)

بخش هشتم: آماده‌سازی، استخراج و سنجش اسیدهای نوکلئیک (Nucleic Acid Extraction & QC)

• پروتکل ۸.۱: پروتکل استخراج DNA ژنومی از خون محیطی به روش سالتینگ‌اوت (Salting-Out High-Yield DNA Extraction)
• پروتکل ۸.۲: پروتکل استخراج DNA از بافت‌های فیکس‌شده در پارافین (FFPE Tissue DNA Isolation)
• پروتکل ۸.۳: پروتکل استخراج DNA از مایع آمنیوتیک و نمونه‌های پرز جنینی بدون آلودگی مادری (Prenatal DNA Isolation - AF & CVS)
• پروتکل ۸.۴: پروتکل استخراج توتال RNA و سنتز رشته اول cDNA از سلول‌های تک‌هسته‌ای مغز استخوان و خون (RNA Extraction & cDNA Synthesis)
• پروتکل ۸.۵: پروتکل ارزیابی کمّی و کیفی اسیدهای نوکلئیک (اسپکتروفتومتری نانودراپ، فلورومتری Qubit و الکتروفورز ژل آگاروز)

بخش نهم: سیتوژنتیک مولکولی سریع و تحلیل قطعات (QF-PCR & Fragment Analysis)

• پروتکل ۹.۱: پروتکل بررسی سریع آنیوپلوئیدی‌های کروموزومی پیش از تولد با تکنیک QF-PCR (کروموزوم‌های ۱۳، ۱۸، ۲۱، X و Y با مارکرهای STR)
• پروتکل ۹.۲: پروتکل ارزیابی حذف‌های ریز کروموزوم Y در ناباروری مردان (Y-Chromosome Microdeletion / AZF Region Analysis)
• پروتکل ۹.۳: پروتکل آنالیز شکنندگی کروموزوم X با متد TP-PCR و تعیین طول تکرارهای CGG ژن FMR1 (Fragile X Syndrome Triplet Repeat Primed PCR)
• پروتکل ۹.۴: پروتکل آماده‌سازی نمونه، لودینگ الکتروفورز موئینگی (Capillary Electrophoresis) و تحلیل سایز قطعات با نرم‌افزارهای GeneMapper / Peak Scanner

بخش دهم: بررسی تغییرات تعداد نسخه ژنی (MLPA & Copy Number Variations)

• پروتکل ۱۰.۱: پروتکل استاندارد واکنش هیبریداسیون، لیگاسیون و تکثیر پروب‌ها در متد MLPA (Standard MLPA Reaction Workflow)
• پروتکل ۱۰.۲: پنل تشخیصی دیستروفی عضلانی دوشن و بکر (DMD/BMD Deletion/Duplication MLPA Assay)
• پروتکل ۱۰.۳: پنل تشخیصی آتروفی عضلانی نخاعی و بررسی تعداد نسخه‌های ژن SMN1/SMN2 (SMA Carrier & Diagnostic Testing)
• پروتکل ۱۰.۴: پنل بررسی سندرم‌های میکرودلیشن و میکرودوپلیکاسیون ساب‌تلومری و بینابینی (Microdeletion Syndromes MLPA: DiGeorge, Williams, Prader-Willi/Angelman)
• پروتکل ۱۰.۵: نرمال‌سازی داده‌های خام، کنترل‌های کیفی و آنالیز نسبت دوز ژنی با نرم‌افزار Coffalyser.Net

بخش یازدهم: واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و تست‌های جهش‌یافته شایع (Diagnostic PCR & Real-Time qPCR)

• پروتکل ۱۱.۱: پروتکل واکنش ARMS-PCR و RFLP-PCR برای جهش‌های نقطه‌ای شایع (مانند جهش‌های ژن بتاگلوبین در تالاسمی)
• پروتکل ۱۱.۲: پروتکل پنل ترومبوفیلی ارثی با Real-Time PCR (فاکتور ۵ لیدن، پروترومبین G20210A و MTHFR C677T/A1298C)
• پروتکل ۱۱.۳: پروتکل پایش کمّی رونوشت همجوشی BCR::ABL1 (p210/p190) در لوسمی میلوئیدی مزمن بر اساس مقیاس بین‌المللی (IS-qPCR)
• پروتکل ۱۱.۴: پروتکل سنجش بار ویروسی (Viral Load Quantification) با ریل‌تایم کمّی

بخش دوازدهم: توالی‌یابی مستقیم سنگر (Sanger Sequencing)

• پروتکل ۱۲.۱: پروتکل طراحی پرایمرهای اختصاصی، بهینه‌سازی PCR ته‌نشینی و تخلیص محصولات PCR (ExoSAP-IT Purification)
• پروتکل ۱۲.۲: پروتکل واکنش توالی‌یابی چرخه‌ای با بیودای‌ها (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing)
• پروتکل ۱۲.۳: پروتکل خالص‌سازی واکنش توالی‌یابی (Ethanol/EDTA Precipitation یا ستون‌های Sephadex)
• پروتکل ۱۲.۴: الکتروفورز در دستگاه آنالایزر ژنتیکی و آنالیز توالی‌ها و کروماتوگرام بر اساس دستورالعمل نام‌گذاری HGVS

بخش سیزدهم: توالی‌یابی نسل جدید در انکولوژی و بیماری‌های تک‌ژنی (NGS: Library Prep & QC)

• پروتکل ۱۳.۱: پروتکل آماده‌سازی کتابخانه ژنومی هدفمند بر پایه آمپلیکون (Amplicon-Based Library Preparation)
• پروتکل ۱۳.۲: پروتکل آماده‌سازی کتابخانه بر پایه تسخیر هیبریداسیونی (Hybridization Capture Target Enrichment)
• پروتکل ۱۳.۳: پنل توالی‌یابی ژن‌های مستعدکننده سرطان پستان و تخمدان ارثی (BRCA1 / BRCA2 NGS Panel)
• پروتکل ۱۳.۴: پنل بیومارکرهای توموری نسج جامد جهت تارگت‌تراپی (KRAS, NRAS, BRAF, EGFR)
• پروتکل ۱۳.۵: کنترل کیفی کتابخانه‌ها، اندازه‌گیری سایز قطعات با بیوآنالایزر و پولینگ نهایی (Library QC, Normalization & Pooling)

بخش چهاردهم: ژنتیک مولکولی باروری و پیش از لانه‌گزینی (Reproductive Molecular Genetics & PGT)

• پروتکل ۱۴.۱: پروتکل تکثیر کل ژنوم از تک‌سلول بلستومر یا بیوپسی تروفکتودرم (Single-Cell Whole Genome Amplification - WGA)
• پروتکل ۱۴.۲: پروتکل PGT-M: بررسی بیماری‌های تک‌ژنی با اتصال پیوستگی مارکرهای STR پیرامون ژن (Linkage Analysis by Multiplex Mini-STR)
• پروتکل ۱۴.۳: پروتکل غربالگری کروموزومی جنین (PGT-A) با تکنیک Low-Pass Whole Genome Sequencing (NGS-based PGT-A)
• پروتکل ۱۴.۴: پروتکل رد آلودگی سلول‌های مادری در تست‌های مولکولی جنین (Maternal Cell Contamination - MCC Clearance Protocol)